Discovery and De Novo Sequencing of Insect Neuropeptides Using the LTQ Orbitrap XL

Význam tématu

Neuropeptidy hrají zásadní roli jako neurotransmitery a neuromodulátory v regulaci fyziologických procesů hmyzu. Vysoce přesné a citlivé de novo sekvenování umožňuje odhalovat nové peptidy a jejich post-translační modifikace, což je klíčové pro pochopení signalizace a potenciální využití jako farmaceutických látek.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat schopnosti instrumentace LTQ Orbitrap XL vybavené oktapolovou kolizní buňkou pro HCD fragmentaci při de novo sekvenování neuropeptidů z hmyzí hypofýzy (corpora cardiaca/allata) Periplaneta americana a P. australasiae. Studie kombinuje nano LC–MS/MS běh s různými režimy fragmentace (CID i HCD) a porovnává výsledky databázového vyhledávání a de novo sekvenování.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky extrahované v 50 % methanolu/0,1 % kyseliny mravenčí byly naředěny a injikovány do nano HPLC (75 µm ID, 15 cm C18). Spektrometrie byla prováděna na LTQ Orbitrap XL v režimu Data Dependent s plným skenem v Orbitrapu (60 000 FWHM) a následnou CID a HCD fragmentací téhož iontu, detekovanou v Orbitrapu.
Software:

• MASCOT 2.1.04 pro databázové vyhledávání v SwissProt a nrNCBI (tolerance 3 ppm/0,05 Da).
• PEAKS Studio 4.5 pro automatizované de novo sekvenování a error tolerant search (tolerance 3 ppm/0,05 Da).

Hlavní výsledky a diskuse

• HCD fragmentace zajišťuje vysokou hmotnostní přesnost (< 3 ppm) a kompletní pokrytí b- a y-iontů ve širokém rozsahu m/z.
• Identifikováno bylo více než 20 známých neuropeptidů (allatostatiny, sulfakininy, pyrokininy, hypertrehalosaemické hormony, corazonin).
• Porovnání CID vs. HCD: CID často postrádá sekvenční informace při modifikacích (např. ztráta SO3), zatímco HCD umožňuje přímé čtení sekvence z jednoho MS/MS spektra.
• Automatizace s PEAKS Studio a SPIDER homology search odhalila 21 dalších potenciálních neuropeptidů, včetně dosud nepopisovaných v druzích Periplaneta.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a spolehlivou identifikaci komplexních neuropeptidů bez předchozích databázových referencí. Tím se otevírá prostor pro objev bioaktivních peptidů s potenciálem farmaceutického využití.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Nasazení kolizních energetických profilů pro optimalizaci fragmentace specifických peptidů.
• Využití base peak ejection pro odhalení nízkouho abundančních látek.
• Detailní charakterizace nově objevených neuropeptidů a jejich biologických funkcí v hmyzu a dalších organismech.

Závěr

Integrace nano LC–MS/MS s LTQ Orbitrap XL a HCD fragmentací představuje robustní platformu pro de novo sekvenování neuropeptidů. Automatizované postupy v kombinaci s databázovým i error tolerantním vyhledáváním rozšiřují repertoár identifikovaných peptidů a podporují objevování nových bioaktivních molekul.

Reference

• Verhaert P.D., Prieto Conaway M.C., Pekar T.M., Miller K., Neuropeptide imaging on an LTQ with vMALDI source; complete all-in-one peptidome analysis. Int. J. Mass Spectrom. 2007, 260, 177–184.