Enhanced Coverage of Insect Neuropeptides in Tissue Sections by an Optimized Mass Spectrometry Imaging Protocol

Význam tématu

Studium a prostorová lokalizace neuropeptidů v hmyzím nervovém systému je klíčové pro pochopení jejich role při regulaci fyziologických funkcí (krmení, reprodukce, metabolismus) a pro vývoj cílených insekticidů. Vysoké prostorové rozlišení a současné pokrytí širokého spektra peptidů umožňuje detailní analýzu neuroendokrinních center a jejich adaptací na vnější faktory.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo optimalizovat protokol MALDI-TOF MSI s použitím přístroje rapifleX pro co nejširší zjištění a lokalizaci hmyzích neuropeptidů v jediné řezu retrocerebrálního komplexu (RCC) švába Periplaneta americana. Studie zahrnovala validaci pokrytí peptidů, prostorovou segmentaci a schopnost rozlišit molekuly s velmi podobnou hmotností.

Použitá instrumentace

• RapifleX MALDI-TOF mass spektrometr (Bruker)
• Kryostaty pro přípravu 14–20 µm tenkých řezů
• ITO povlakované sklíčka
• SunCollect Dispenser pro nanášení matrice (CHCA)
• Software flexAnalysis, flexImaging a SCiLS Lab pro analýzu MSI dat

Použitá metodika

Příprava vzorků zahrnovala embedování RCC v 120 mg/ml želatině, zmrazování na –50 °C a sekci na 14–20 µm. Řezy byly odmaštěny ethanolovými praními, vysušeny ve vakuu a poté potaženy 5 mg/ml CHCA v 50 % acetonitrilu s 2 % TFA. Data byla pořízena v pozitivním reflect mode v rozsahu m/z 600–3200 s krokem 15 µm a frekvencí laseru 5 kHz.

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekce více než 100 peptidů včetně ~60 bioaktivních neuropeptidů z 15 genů v jednom řezu
• Prostorová segmentace odlišila části RCC: corpora allata, nervi corporis allati, glandulární a neurohemální corpora cardiaca rozdělená na tři subkompartmenty
• Rozložení neuropeptidů korazonin, allatostatin-A a pyrokininy odpovídalo známým projekcím z mozku a ganglií
• Diferenciace molekul s hmotnostní odchylkou pouhých 0,2 Da díky vysoké rozlišovací schopnosti spektrometru

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný protokol poskytuje vysokou reprodukovatelnost, kvalitu signálu a prostorové rozlišení, což umožňuje detailně sledovat zpracování a distribuci neuropeptidů. Metoda překonává omezení imunohistochemie v rozlišení paracopy a rozšiřuje možnosti studia dopadu insekticidů a stresových faktorů na neuroendokrinní systém hmyzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na další modelové druhy hmyzu a studium vývoje neuropeptidomu v čase
• Integrace kvantitativních přístupů a víceomických metod pro komplexní biochemický profil
• Využití v prediktivním testování účinnosti a specificity nových insekticidů
• Sledování adaptací na environmentální stresory a xenobiotika v reálném čase

Závěr

Optimalizovaný MALDI-MSI protokol pro rapifleX MALDI-TOF umožňuje široké pokrytí a přesnou lokalizaci hmyzích neuropeptidů v RCC P. americana. Metoda poskytuje platformu pro pokročilé výzkumy neuroendokrinní regulace a vývoj selektivních insekticidů.

Reference

1. Gundel M, Penzlin H, Cell Tissue Res., 1980, 208:283–297.
2. Ly A, Ragionieri L et al., Anal Chem., 2019, 91:1980–1988. doi:10.1021/acs.analchem.8b04304.
3. Neupert S, Fusca D et al., J Comp Neurol., 2012, 520:694–716. doi:10.1002/cne.22745.