Extraction of Multiple Mycotoxins From Nuts Using ISOLUTE® Myco prior to LC-MS/MS Analysis

Význam tématu

Mykotoxiny jsou toxické metabolity produkované plísněmi, které kontaminují potraviny včetně ořechů. Jejich přítomnost ohrožuje zdraví spotřebitelů i kvalitu potravinářských výrobků. Evropské předpisy stanovují limity a metody pro stanovení mykotoxinů, aby byla zajištěna bezpečná spotřeba a mezinárodní obchod. Spolehlivá extrakce a analýza více tříd mykotoxinů je proto klíčová pro rutinní kontrolu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace AN784 bylo vyvinout a validovat jednoduchý postup vzorkování a přípravy vzorku s využitím ISOLUTE® Myco SPE kolonek pro extrakci pěti hlavních mykotoxinů (aflatoxin B1, B2, G1, G2 a ochratoxin A) z brazilských ořechů a arašídů. Následná LC-MS/MS analýza měla prokázat dosažení požadovaných parametrů přesnosti, opakovatelnosti a citlivosti podle evropských norem.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly nejprve rozdrceny a z 5 g mletého materiálu extrahovány 20 mL směsi acetonitril–voda (80:20, v/v) třepáním 30 min, poté odstředěny. Čistý extrakt se naředil na 32 mL, znovu odstředil a 3 mL supernatantu bylo aplikováno na SPE kolonku ISOLUTE Myco (60 mg/3 mL). Postup SPE zahrnoval kondicionaci (2 mL acetonitrilu), ekvilibraci (2 mL 10 mM CH3COONH4), naložení vzorku, dvě fáze laváže (10 mM CH3COONH4 a směs 10 mM CH3COONH4:acetonitril 90:10), sušení a dvoufázovou eluční extrakci kyselinou ve formě acetonitrilu a methanolu. Eluát byl koncentrován proudem vzduchu nebo dusíku, rekonstituován v 1 mL roztoku 0,1 % kyseliny octové v 20 % acetonitrilu:methanolu a vyfiltrován PTFE filtrem 0,2 µm před LC-MS/MS.

Použitá instrumentace

• SPE kolonky ISOLUTE® Myco 60 mg/3 mL
• TurboVap® LV pro odpařování eluátů
• Shimadzu Nexera UHPLC s kolonkou Kinetex XB-C18 (50×2,1 mm, 2,6 µm)
• AB Sciex Triple Quad™ 5500 s ESI zdrojem Turbo-V
• SPE Dry manifold, centrifuga, třepačka

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala v obou matricích výbornou linearitu (r² 0,9939–0,9993) v rozsahu 0,1–10 ng/µL (odpovídá 1–10 µg/kg). Skutečné LOQ se pohybovalo u aflatoxinů na úrovni 1 µg/kg a u ochratoxinu A kolem 1 µg/kg. Opakovatelnost (%RSDr) byla nižší než 7,2 % a průměrné recuperace dosažily 90–113 %, což splňuje cílové limity 50–120 %. Extrahované iontové chromatogramy ukázaly dobře rozlišené píky pro všech pět mykotoxinů při koncentraci 5 µg/kg.

Přínosy a praktické využití metody

Protokol umožňuje simultánní extrakci a analýzu více tříd mykotoxinů jedinou SPE kolonou, čímž zjednodušuje a zrychluje přípravu vzorků. Dosažená citlivost a robustnost jsou vhodné pro rutinní sledování kvality v potravinářských laboratořích a pro ověřování souladu s legislativními požadavky.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na další potravinářské matice (obilniny, koření, sušené ovoce).
• Automatizace SPE kroků a on-line spojení s LC-MS/MS.
• Miniaturizace a zvýšení citlivosti využitím high-resolution MS.
• Adaptace na detekci nově identifikovaných mykotoxinů.

Závěr

ISOLUTE® Myco SPE protokol poskytuje spolehlivou, rychlou a vysoce výkonnou přípravu vzorků pro simultánní extrakci aflatoxinů B1, B2, G1, G2 a ochratoxinu A z ořechových matric. Metoda splňuje přísné požadavky na LOQ, opakovatelnost a recuperace podle evropských norem, což ji činí ideální pro kontrolní laboratoře.

Reference

Biotage. Extraction of Multiple Mycotoxins From Nuts Using ISOLUTE® Myco prior to LC-MS/MS Analysis. Application Note AN784, 2013.