Dynamic Binding Capacity and High‑Resolution Oligonucleotide Analysis with Agilent Bio SAX Columns

Význam tématu

Oligonukleotidy jsou klíčovými molekulami v molekulární biologii, diagnostice a terapeutickém výzkumu. Je důležité mít spolehlivou metodu pro jejich analytickou separaci a kvantifikaci, která zajistí vysoké rozlišení a reprodukovatelnost bez použití volatilních iontově-parných činidel.

Cíle a přehled studie

Tato technická studie se zaměřuje na hodnocení dynamické vazební kapacity (DBC) a analytických schopností Agilent Bio SAX aniontově-výměnných sloupců při separaci oligonukleotidů o délce 25 až 100 bazí. Studie porovnává sloupce s částicemi o velikosti 1,7, 5 a 10 µm a zkoumá vliv délky oligonukleotidů na vazební kapacitu.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda spočívá v aniontové výměnné chromatografii s gradientem koncentrace NaCl. Vzorky oligonukleotidů jsou rozpuštěny v Tris pufru (pH 8,0) a jejich koncentrace je stanovena spektrofotometricky.

• Mobilní fáze A: 10 mM Tris, pH 8,0
• Mobilní fáze B: 2 M NaCl v pufru A
• Gradient: od 0 do 100 % B v analytických bězích
• Teplota kolony: 25 °C pro DBC, 80 °C pro vysokoteplotní separace
• Flow rate: 0,5 mL/min

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC systém
• Pumpa G7132A, multisampler G7137A s termostatem
• Multicolumn thermostat G7116B s biokompatibilním výměníkem tepla
• Diode array detektor G7115A s bio-inertní flow cell
• Agilent Bio SAX sloupce NP1.7, NP5 a NP10 (4,6 × 50 mm)

Hlavní výsledky a diskuse

Byla stanovena dynamická vazební kapacita pro sloupce různých velikostí částic:

• NP1.7 µm: přibližně 8,5 mg/mL kolonového objemu
• NP5 µm: přibližně 6,5 mg/mL kolonového objemu
• NP10 µm: přibližně 3,2 mg/mL kolonového objemu

Výsledky ukazují nezávislost vazební kapacity na délce oligonukleotidu a potvrzují, že menší částice poskytují vyšší kapacitu díky větší ploše aktivního povrchu. Analytické chromatogramy pro 25, 50, 75 a 100 mer ukázaly vynikající rozlišení primárních produktů a nečistot. Rozlišení n-1 oligonukleotidů v RNA standardu dokazuje špičkovou selektivitu sloupce.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoké rozlišení a reprodukovatelnost LC-UV analýzy oligonukleotidů
• Bezpečné použití bez iontově-parných činidel
• Rychlé čištění a separace v biotechnologické a farmaceutické kvalitě

Budoucí trendy a možnosti využití

• Propojení AEX s hmotnostní spektrometrií pro detailní charakterizaci
• Optimalizace pro delší a modifikované oligonukleotidy
• Automatizace vysokopropustných platform pro výzkum a QA/QC

Závěr

Agilent Bio SAX AEX sloupce představují robustní nástroj pro kvalitativní a kvantitativní analýzu oligonukleotidů. Velikost částic umožňuje volbu mezi vyšší kapacitou a rychlostí separace podle požadavků aplikace. Uživatelé by měli provést validaci pro své specifické molekuly a kritéria čistoty.

Reference

1. Cook K, Thayer J Advantages of Ion-Exchange Chromatography for Oligonucleotide Analysis Bioanalysis 2011 3(10) 1109–1120
2. Hsiao J Apffel A Turner M Optimizing Separation of Oligonucleotides with Anion-Exchange Chromatography Agilent Technologies Application Note 2022