Oligonucleotide Purification using Anion Exchange Liquid Chromatography

Význam tématu

Čisté syntetické oligonukleotidy hrají klíčovou roli v biochemickém výzkumu, vývoji nových léčiv a molekulárně biologických aplikacích. Efektivní oddělení cílového produktu od strukturálně blízkých nečistot je nezbytné pro zajištění vysoké kvality a reprodukovatelnosti výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem článku je poskytnout komplexní přehled procesu objednávky spotřebního materiálu a optimálních podmínek pro purifikaci oligonukleotidů pomocí aniontové výměnné chromatografie (AEC) na základe polymerních PL-SAX stacionárních fází. Studie popisuje faktory ovlivňující volbu chemie kolon, velikosti pórů a částic, stejně jako optimalizaci mobilních fází a provozních parametrů.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika je založena na aniontové výměnné chromatografii s mobilními fázemi obsahujícími běžné pufry (tris, fosfát, EDA-HCl) a sůl NaCl pro eluci. Důraz je kladen na:

• Volbu správné chemie kolon (PL-SAX 1000 Å pro oligo délky 10–200 bází, 4000 Å pro mRNA).
• Optimalizaci pH (8–12), teploty (30–80 °C) a organických přísad (acetonitril 10–15 %).
• Analytickou i preparativní purifikaci s udržením doporučených lineárních rychlostí (180–360 cm/h).

Instrumentace:

• Agilent PL-SAX aniontové výměnné kolony v rozměrech od 2,1 × 50 mm až po 100 × 300 mm a velikostech částic 5–30 μm.
• Agilent Infinity II LC systémy: 1220/1260/1290 pro analytickou a 1260, 1290 preparativní purifikaci (průtoky 0,1–480 mL/min).
• Systémy pro semipreparativní i přípravné stupně včetně Load & Lock sloupců a bulk médií.

Hlavní výsledky a diskuse

Syntéza oligonukleotidů dosahuje často až 99 % efektivity spojení, přesto konečná výtěžnost pro 25 mer je nižší než 80 % kvůli tvorbě blízkých nečistot. Delší sekvence vykazují složitější profil nečistot (n-1, n-2, ztráty bází, oxidace). Studie demonstruje:

• Schopnost vysokého pH a teploty zlepšit rozlišení oxidačních a štěpných nečistot.
• Vliv organických modifikátorů na ostrost píků a prevenci precipitace soli.
• Postup optimalizace analytických podmínek (gradient, pH, teplota) s následným škálováním na semipreparativní a preparativní kolony pomocí rovnice lineární rychlosti a ekvivalentních teoretických destiček.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený workflow nabízí cenově efektivní, reprodukovatelný proces purifikace oligonukleotidů různých délek a typů (siRNA, gRNA, mRNA). Metoda je vhodná pro rutinní UV detekci a velkoobjemovou purifikaci, kde vysoké koncentrace soli nebrání výkonu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj:

• Integrace vazebných médií s vyšší stabilitou při extrémním pH a teplotách.
• Automatizace příprav a škálování pomocí Load & Lock sloupců a mobilního balení médií.
• Kompatibilita s hmotnostní spektrometrií při nižších až středních průtocích a použití kompatibilních iontových párů.

Závěr

Agilent PL-SAX aniontová výměnná chromatografie poskytuje robustní a flexibilní řešení pro purifikaci oligonukleotidů od analytických až po procesní škály. Doporučené postupy pro výběr kolon, podmínek, škálování a péči o kolony zaručují vysokou účinnost, rozlišení a životnost.

Reference

1. High Resolution Separations of Oligonucleotides using PL-SAX Strong Anion-Exchange HPLC Columns, 5990-8297EN.
2. Agilent PL-SAX Anion-Exchange Media for Nucleotide and Oligonucleotide Analysis, 5990-8779EN.
3. Purification of Single-Stranded RNA Oligonucleotides Using High-Performance Liquid Chromatography, 5994-3514EN.
4. Direct Analysis of In-Process Oligonucleotides Without Manual Purification, 5991-9490EN.
5. Improved Column Lifetime with Thermally Stable Polymer Columns for Oligonucleotide Ion-Pair RP HPLC, 5990-7764EN.
6. Use Temperature to Enhance Oligonucleotide Mass Transfer and Improve Resolution in Ion-Pair RP HPLC, 5990-7765EN.
7. Purify Your Way, Agilent Lock & Load Columns, 5994-3907EN.
8. Agilent InfinityLab LC Purification Solutions, 5991-9153EN.
9. Purify Your Samples with Maximum Flexibility, 5991-9154EN.