A Tale of Two Samples: Understanding the Purification Workflow from Different Perspectives Part 2: High-throughput purification

Význam tématu

Reverzní fáze kapalné chromatografie (RPLC) je klíčová technika nejen pro kvantitativní analýzu, ale i pro preparativní purifikaci. Vysokoprůchodové workflow umožňuje rychlé zpracování mnoha vzorků s cílem dosáhnout vysoké čistoty a průchodnosti, což je zásadní v objevových studiích a farmaceutickém výzkumu.

Cíle a přehled studie / článku

Článek druhé části přehledu popisuje optimalizaci workflow pro vysokoprůchodovou purifikaci 6-gingerolu z přírodního extraktu zázvoru. Klíčovým cílem je maximalizovat čistotu a průchodnost za přijatelnou ztrátu výtěžku.

Použitá metodika

Postup vývoje purifikační metody zahrnuje šest kroků:

1. Kontrola rozpustnosti vzorku a prevence precipitace pomocí inline filtru.
2. Přehledné screeningové testy stacionární a mobilní fáze na úzkoprůběžných kolónách 2.1 × 50 mm, 1.9 µm s rychlým gradientem.
3. Optimalizace kritického páru pomocí zaměřeného gradientu sníženým sklonem pro lepší rozlišení 6-gingerolu od blízko elujících nečistot.
4. Stanovení maximálního naložení cíleného na čistotu spíše než výtěžek.
5. Geometrické škálování analytické metody na preparativní kolónu 21.2 × 150 mm, 4 µm pro zachování retence a rozlišení.
6. Purifikace s cíleným sběrem vrcholu se spuštěním sběru na základě prahové hodnoty signálu.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity II pro analytické práce
• Agilent 1290 Infinity II Preparative LC pro preparativní purifikaci
• Agilent InfinityLab Poroshell HPH C18 kolóny 2.1 × 50 mm, 1.9 µm a 21.2 × 150 mm, 4 µm
• Agilent Captiva Premium 0.45 µm injektážní filtry
• HPLC grade acetonitril a voda formiová kyselina

Hlavní výsledky a diskuse

Použití kolóny 2.1 × 50 mm, 1.9 µm poskytlo rozlišovací výkon L/dp 26.3 podobný klasické 150 mm, 5 µm kolóně, avšak s až 67 % kratším časem analýzy. Zaměřený gradient 45–55 % B ve 6.3 min sklon 1.6 %/min zvýšil rozlišení 6-gingerolu od blízko elujících nečistot. Preparativní kolóna SPP umožnila zkrátit dobu běhu na 10 min oproti 18 min na TPP, čímž se téměř zdvojnásobila průchodnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlejší screeningové workflow šetří čas v objevových studiích
• Zaměřené gradienty zvyšují čistotu sbírané frakce
• SPP preparativní kolóny umožňují vyšší průtoky bez ztráty rozlišení
• Inline filtry zabraňují ucpání kolóny při práci se silnými rozpouštědly

Budoucí trendy a možnosti využití

Předpokládá se širší integrace hmotnostní detekce pro selektivní spuštění sběru frakcí, další miniaturizace kolón a automatizace workflow propojením s vysokorychlostními hmotovými spektrometry. Rovněž se uvažuje o využití zelenějších mobilních fází a umělé inteligence pro optimalizaci gradientů.

Závěr

Optimalizace vysokoprůchodové preparativní purifikace kombinuje úzkoprůběžné screeningové metody s SPP kolónami a zaměřenými gradienty. Tímto přístupem lze dosáhnout vysoké čistoty a značného nárůstu průchodnosti za přijatelnou ztrátu výtěžku.

Reference

• Agilent Technologies A Tale of Two Samples TEO Part 1 Bulk purification 2022 publ 5994-4707EN
• USP Chapter 621 Chromatography USP 40 NF 35 2017 str 508-520
• High Throughput Purification Platform in Support of Drug Discovery ACS Comb Sci 2012 14 51-59
• Subbarao Developing Fast Purification Methods for Natural Products Using Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB C18 Preparative LC Column Agilent Application Note 5994-3518EN 2021