A Tale of Two Samples: Understanding the Purification Workflow from Different Perspectives - Part 1: Bulk purification

Význam tématu

Reverzní fázová kapalná chromatografie (RPLC) představuje klíčový nástroj nejen pro analytickou praxi, ale i pro přípravné čištění syntetických látek, kde je rozhodující dosažení vysoké čistoty a výtěžku.

Cíle a přehled studie / článku

Tato první část seriálu popisuje workflow pro bulk purification, jehož cílem je izolovat 200–300 mg cílové malomolekulární sloučeniny s maximální čistotou a výtěžkem za využití Agilent systémů.

Použitá metodika a instrumentace

• Analytický systém: Agilent 1260 Infinity II LC
• Preparativní systém: Agilent 1290 Infinity II preparative LC
• Kolony: Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18 (3,0×150 mm, 4 µm), InfinityLab Pursuit XRs C18 (4,6×150 mm, 5 µm) a Pursuit XRs C18 (30,0×150 mm, 5 µm)
• Filtrace vzorku: Agilent Captiva Premium 0,45 µm
• Mobilní fáze: voda a acetonitril s 0,1 % kyselinou mravenčí

Metoda zahrnuje šest kroků: ověření rozpustnosti ve vzorkovém ředidle; screening stacionárních a mobilních fází; optimalizaci separace kritického páru; stanovení maximálního naložení kolony; geometrické škálování analytických podmínek na preparativní systém včetně korekce dwell time; a finální purifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

• Směs byla rozpustná do 20 mg/ml v 25:75 ethanol:voda.
• Screening na C18 fázích ukázal nejlepší separaci s gradientem vody–acetonitrilu.
• Optimalizovaný gradient minimalizoval překryv kritického páru při ~44 % organické fáze.
• Geometrické škálování vedlo k průtoku 42 ml/min a injekčnímu objemu 3000 µl.
• Série injekcí (60 mg na injekci) přinesla produkt s čistotou >99 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Workflow zajišťuje vysokou čistotu a výtěžek.
• Rychlé škálování z analytických podmínek urychluje vývoj.
• Korekce dwell time zabezpečuje stabilní retence a reprodukovatelnost.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace screeningových a purifikačních kroků pro high-throughput prostředí.
• Implementace rychlých fází a menších částic pro zkrácení analýzy.
• Využití zelenějších rozpouštědel a tlakových systémů pro udržitelnou purifikaci.

Závěr

Ukázaný přístup systematického vývoje bulk purification optimalizuje zisk a čistotu cílového produktu. Klíčové je pečlivé testování jednotlivých kroků, škálování a korekce instrumentálních parametrů.

Reference

1. A Tale of Two Samples: Understanding the Purification Workflow from Different Perspectives Part 2: High-Throughput Purification, Agilent Technologies, 2022, 5994-4708EN
2. The LC Handbook, Guide to LC Columns and Method Development, Agilent Technologies, 2016, 5990-7595EN
3. Principles and Practical Aspects of Preparative Liquid Chromatography, Agilent Technologies Primer, 2019, 5994-1016EN