Absolute Quantitation of Fragile Metabolites by Isotope Dilution Mass Spectrometry on the Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS

Význam tématu

Metabolomická analýza křehkých metabolitů je klíčová pro pochopení buněčného metabolismu, diagnostiku i vývoj léčiv. Tyto látky se často štěpí během přípravy či v iontovém zdroji, což snižuje citlivost, reprodukovatelnost a přesnost kvantifikace. Rozvoj metod, které minimalizují degradaci a zároveň umožňují spolehlivou absolutní kvantifikaci v komplexních matricích, je proto v praxi zásadní.

Cíle a přehled studie

Studie byla rozdělena do dvou částí:

• Srovnání citlivosti a zachování křehkých metabolitů mezi Agilent 6495 LC/TQ s iFunnel a non-iFunnel Agilent 6470 LC/TQ.
• Vývoj robustní metody absolutní kvantifikace fragilních metabolitů v komplexní matrice pomocí izotopické ředicí hmotnostní spektrometrie (IDMS) a 13C označených yeast extract interních standardů.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: Agilent 6495 LC/TQ s třetí generací iFunnel a pro porovnání Agilent 6470 LC/TQ (oba AJS negative mód).
• Kolona: ZORBAX Extend C18 s guard kolónou a přepínacím ventilem pro backflush čištění.
• Chromatografie: gradient mezi vodou/methanolem (97/3) s tributylaminem, octanovou kyselinou a aditivem InfinityLab a čistým methanolem s aditivem.
• Iontový zdroj: teplota sušicího plynu 150 °C, sheath gas 325 °C, nebulizér 45 psi, HPF RF ~80 V, LPF RF ~70 V.
• Detekční režim: dynamický MRM pro 219 centrálních metabolitů v negat. módu.
• Příprava vzorků: extrakt z 13C označených kvasinek (Pichia pastoris) jako interní standard, s dvojím ředěním standardů a vzorků při konstantním množství kvasinek.

Hlavní výsledky a diskuse

• Systém s iFunnel přinesl zvýšení poměru signál/šum 5–10× u řady fragilních metabolitů oproti non-iFunnel přístroji.
• Full scan spektra byla mezi přístroji shodná, bez předčasné fragmentace křehkých sloučenin.
• Detekční limity dosahovaly stovek attomolů na kolonku, lineární kvantifikační rozsah činil 6–8 řádů.
• IDMS s 13C kvasinkami umožnilo kompenzovat iontovou potlačenost i variabilitu přípravy vzorků a dosáhnout R2 >0,99 u kalibračních křivek.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená analytická citlivost a robustnost bez nutnosti derivatizace.
• Spolehlivá reprodukovatelnost a přesná absolutní kvantifikace v širokém dynamickém rozsahu.
• Eliminace nutnosti dodatečného soustředění či naředění vzorků.
• Úspora nákladů i času díky využití 13C označených yeasts extract jako univerzálních interních standardů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zdokonalování iFunnel konstrukce pro širší spektrum křehkých sloučenin včetně lipidů a menších peptidů.
• Integrace se systémy vysokorozlišovací MS pro komplexní metabolomiku a lipidomiku.
• Automatizace přípravy vzorků a rozvoj softwaru pro správu 13C interních standardů ve vysokopropustných laboratořích.
• Rozšiřování isotopických strategií a rozšíření databází MRM metod.

Závěr

Agilent 6495 LC/TQ s iFunnel prokázal výrazné zvýšení citlivosti a schopnost zachovat fragilní metabolity bez předčasné fragmentace. Absolutní kvantifikace pomocí IDMS s 13C kvasinkami poskytuje přesné a reprodukovatelné výsledky v extenso dynamickém rozsahu, což usnadňuje aplikaci v biomedicínském i průmyslovém výzkumu.

Reference

• Sartain M. The Agilent Metabolomics Dynamic MRM Database and Method. Agilent Technologies, 2016.
• Hermann G. et al. 13C-Labelled Yeast as Internal Standard for LC-MS/MS and LC High Resolution MS Based Amino Acid Quantification in Human Plasma. J. Pharm. Biomed. Anal., 2018;155:329–334.
• Metabolomics Dynamic MRM Method Setup Guide. Agilent Technologies, G6412-90002.
• Creek D.J. Stable Isotope Labeled Metabolomics Improves Identification of Novel Metabolites and Pathways. Bioanalysis, 2013;5(15):1807–1810.