Quantitation of TCA Cycle with Automated Sample Prep, Reproducible HILIC Chromatography and Ion Funnel Triple Quadrupole

Význam tématu

Metabolitický trikarboxylátový cyklus (TCA) je klíčovou centrální drahou buněčného metabolismu zodpovědnou za oxidaci živin a podporu bioenergetiky. Dynamické změny v TCA cyklu se podílejí na regulačních mechanismech v patologiích, jako je rakovina, a na imunitních odpovědích. Přesná a absolutní kvantifikace TCA metabolitů je proto zásadní pro pokročilé výzkumné aplikace v biomedicíně, farmakologii i v průmyslové analytice.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované studie bylo vyvinout plně automatizovaný, robustní a reprodukovatelný workflow pro absolutní kvantifikaci klíčových TCA metabolitů v komplexních vzorcích (bovinná plazma a buněčné extrakty). Kombinace automatizovaného vzorkového šetření, metal-free HILIC chromatografie a citlivé detekce na Agilent 6495D LC/TQ měla zajistit široký dynamický rozsah, vysokou reprodukovatelnost a nízké hodnoty RSD.

Použitá metodika a instrumentace

Pracovní postup zahrnoval:

• Automatizovanou extrakci pomocí Bravo Metabolomics Sample Prep Platform s Captiva EMR-Lipid SPE destičkou pro plazmu i buňky.
• Chromatografii na HILIC-Z kolóně (Agilent Poroshell 120 HILIC-Z, 2.1×150 mm, 2.7 μm), teplota kolóny 15 °C, autosampler 4 °C, mobilní fáze A (20 mM octan amonný, pH 9.3, medronová kyselina), B (ACN), gradientní program 0–19 min, průtok 0.4 mL/min.
• Detekci na Agilent 6495D mikročtvercovém trojčipu s 4. generací ion funnel (iFunnel), nastavení Fragile vs. Standard iFunnel módů, teploty plynů a napětí optimalizované skrze MassHunter Acquisition 12.1 s databází MRM přechodů.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované přechody pro 13C-značené TCA metabolity doplnily databázi HILIC workflow a umožnily absolutní kvantifikaci dvanácti klíčových sloučenin. Fragile iFunnel mód zlepšil citlivost detekce ve srovnání se Standard módem až o 124 %. Kalibrační křivky pokrývaly rozsah 1–100 000 nM se součiniteli korelace >0,995 a RSD <10 %. Vzorky bovinné plazmy i buněčných extraktů vykázaly koncentrace v rámci kalibrace s nízkou variabilitou (RSD <9 %).

Přínosy a praktické využití metody

Propracovaný end-to-end workflow poskytuje:

• Automatizovanou, vysokopropustnou přípravu vzorků.
• Reprodukovatelnou chromatografii pro metal-citlivé analyty.
• Citlivou kvantifikaci přes široký dynamický rozsah na LC/TQ.

Metoda je vhodná pro biomarkerové studie, farmakokinetiku a metabolické sledování buněčných drah.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření panelu analyzovaných metabolitů, integrace plně vystuženého 13C izotopového sledování toků a nasazení umělé inteligence pro automatizovanou interpretaci výsledků. Další rozvoj miniaturizace a dálkové správy platformy může zvýšit efektivitu a propustnost.

Závěr

Předložený workflow spojuje automatizovanou přípravu vzorků, reprodukovatelnou HILIC chromatografii a citlivou detekci na Agilent 6495D LC/TQ pro spolehlivé absolutní kvantitativní analýzy TCA cyklu. Výsledky ukazují vysokou citlivost, linearitu a nízkou variabilitu, což umožňuje robustní aplikace v biomedicínském i průmyslovém výzkumu.

Reference

1. Yamamoto T. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 584, 53–59 (2021)
2. Yannell K. et al. An End-to-End Targeted Metabolomics Workflow. Agilent Application Note 5994-5628EN (2023)
3. Van de Bittner G.C. et al. Automated Dual Metabolite + Lipid Sample Preparation. Agilent Application Note 5994-5065EN (2022)
4. Sartain M. et al. Automated Low-Volume Plasma Metabolite Extraction. Agilent Application Note 5994-2156EN (2020)
5. Yannell K. et al. Mastering HILIC-Z Separation. Agilent Application Note 5994-5949EN (2023)