Applying cDDA-eXd on a timsOmni to the analysis of the Fab regions of antibodies originating from human serum

Význam tématu

Protein-centrická proteomika představuje moderní přístup k analýze bílkovin přímo ve formě jejich proteoform, bez štěpení na peptidy. Metody jako top-down LC-MS s elektronovým zachycováním (ECD) umožňují odhalit posttranslační modifikace, izoformy a heterogenitu vzorků, což je zásadní pro kvalitativní i kvantitativní analýzu v biologickém výzkumu i farmaceutickém průmyslu, zejména při charakterizaci protilátkových fragmentů (Fab).

Cíle a přehled studie

Cílem této práce je demonstrovat nasazení metody cDDA-eXd (charge-based data-dependent acquisition s ECD) na přístroji timsOmni (Bruker) pro nepředem cílenou charakterizaci Fab oblastí protilátek izolovaných z lidské séra a z čistých biofarmaceutických přípravků. Studie zkoumá možnosti dynamického výběru nábojových stavů, optimalizaci akumulace i fragmentace a hodnotí analytickou výkonnost na reálných vzorcích.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: směs šesti lidských IgG1 byla enzymaticky štěpena proteázou IgdE za účelem získání Fab fragmentů; fragmenty byly rekonstituovány v roztoku H2O + 0,1 % FA a uchovávány zmražené.
Sekvenční separace: reverzní fázová kapilární HPLC kolona MAbPac s gradientem 23–33 % acetonitrilu a 0,1 % FA během 20 až 21 minut.
MS instrumentace:

• Bruker timsOmni IMS Q-Omnitrap-ToF
• Electrospray zdroj CaptiveSpray
• in-source CID (40 eV) pro předběžné odstínění
• dynamická akumulace iontů a on-the-fly dekonvoluce nábojových stavů (cDDA)
• elektronové zachycení (ECD) v Omnitrap buňce při kinetické energii ~1 eV

Data zpracována softwary DataAnalysis a OmniScape.

Hlavní výsledky a diskuse

cDDA-ECD přineslo tyto klíčové výstupy:

• Snížení chimerických spekter díky dynamickému výběru výhradně nezkombinovaných nábojových stavů
• Vysoké rozlišení a věrné zobrazení izotopických vzorců pro masivní fragmenty, což podporuje jednoznačné přiřazení fragmentů
• Řada sekvenčních spekter Fab fragmentů (např. Campath a Trastuzumab ~47–48 kDa) s vysokou signál-šum poměrem získaných MS2 skenů při frekvenci kHz
• Kumulativní skenování různých nábojových stavů vedlo k rozšířené sekvenční pokrytí a zvýšené analytické jistotě

Přínosy a praktické využití metody

Top-down cDDA-ECD na timsOmni nabízí rychlou a robustní platformu pro:

• Nepředem cílenou charakterizaci komplexních vzorků sérových Fab fragmentů
• Kvalitativní i kvantitativní kontrolu biofarmaceutik a jejich modifikací
• Mapování heterogenity proteoform a detekci mutací či posttranslačních modifikací v reálném čase LC-MS

Budoucí trendy a možnosti využití

Plánované směry rozvoje:

• Nasazení elektronového dopadového rozkladu (EID) pro zvýšení výtěžnosti fragmentů v oblastech Fab obtížně přístupných ECD
• Optimalizace chromatografie pro biologicky odvozené Fab fragmenty, včetně integrace iontově-mobilitní separace
• Automatizace workflows pro vysokoprůchodovou analýzu kolekcí protilátek a dalších proteoform

Závěr

Studie jasně dokládá, že kombinace cDDA a ECD na platformě timsOmni umožňuje vysoce věrohodné top-down analýzy Fab fragmentů v LC-MS měřítku. Metoda dosahuje vysokého rozlišení fragmentace, minimalizuje chimerické signály a poskytuje robustní datový základ pro rutinní použití v proteomice i farmaceutické kvalitě.

Reference

1. den Boer MA, Greisch JF, Tamara S, Bondt A, Heck AJR. Selectivity over coverage in de novo sequencing of IgGs. Chem Sci. 2020; DOI:10.1039/d0sc03438j