Rapid quantitative analysis of vitamins K1 and K2 with chromatographic resolution from matrix interferences for clinical research

Význam tématu

Vitaminy K1 a K2 mají zásadní roli v regulaci srážlivosti krve a metabolismu kostí. Jejich vysoká lipofilita a přítomnost rušivých komponent v biologických matricích vyžadují citlivé a selektivní analytické metody pro klinický výzkum.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout jednoduchý časově úsporný postup pro kvantitativní stanovení vitaminu K1 a menachinonů MK-4 a MK-7 v lidské plazmě. Klíčové bylo oddělení analytů od interferujících matrixových složek a validace assay pro klinické aplikace.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy upravené odstraněním lipidů byly extrahovány precipitací bílkovin acetonitrilem v poměru 1:3, následovala evaporace a rekonstituce v počátečním mobilním prostředí. Interním standardem byl deuterovaný vitamin K1 d7. Analýzu zajišťovala UHPLC separace na Accucore Biphenyl kolonu 50×2,1 mm, 2,6 µm, s rychlým během 3,5 minuty. Detekce probíhala pomocí tandemového kvadrupólového hmotnostního spektrometru s pozitivní ESI ionizací.

• UHPLC systém Vanquish Horizon se základní jednotkou, binárním čerpadlem, vzorkovačem a termostatovanou kolonkou s aktivním předehřívačem
• Accucore Biphenyl analytická kolona 50×2,1 mm, 2,6 µm
• TSQ Endura triple-stage kvadrupólový mass spektrometr
• UHPLC-MS reagencie včetně vody, methanolu, acetonitrilu Optima, formic acid a ammonium formate

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla dolní meze kvantifikace 0,1 ng/mL a lineárního rozsahu do 10 ng/mL. Kalibrační křivky vykázaly koeficienty determinace nad 0,99 a odchylky bias v mezích ±6 %. Precision CV se pohybovalo pod 4 %. Chromatografické oddělení účinně minimalizovalo vliv fosfolipidů sledovaných neutrálním úbytkem fragmentu m/z 184, což zvyšuje robustnost metody. Doporučená alternativa pro rozlišení cis/trans izomerů K1 je Accucore C30 kolona.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený postup kombinuje rychlou a jednoduchou přípravu vzorku s vysoce selektivní UHPLC separací, čímž umožňuje spolehlivé rutinní stanovení vitaminu K v klinických a regulačních laboratořích. Vysoká průchodnost a minimální zásahy do vzorku podporují studie farmakokinetiky i QA QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může zahrnovat rozšíření panelu menachinonů, použití C30 kolony pro detailní izomerickou analýzu, plně automatizované pracovní postupy a multiplexní detekci několika vitaminů a biomarkerů v jednom běhu.

Závěr

Jednostupňová precipitace bílkovin a selektivní UHPLC separace na biphenyl kolonu poskytují robustní, citlivou a rychlou metodu kvantifikace vitaminu K1, MK-4 a MK-7 s minimálním vlivem matrixových interferencí vhodnou pro klinické výzkumné aplikace.

Reference

• Guo X Lankmayr E Phospholipid based matrix effects in LC MS bioanalysis Future Science 2011 3 4 349 352
• Ismaiel O kolektiv Monitoring phospholipids for assessment of ion enhancement and ion suppression in ESI and APCI LC MS MS for chlorpheniramine in human plasma and the importance of multiple source matrix effect evaluations Journal of Chromatography B 2008 875 2 333 343
• Hillbeck D Separation of a Mixture of Vitamin K Isomers Using a Solid Core HPLC Column at Sub ambient Temperature Thermo Fisher Scientific Application Note 20590