High Throughput Peptide Mapping with the Vanquish UHPLC System and the Q Exactive HF Mass Spectrometer

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek je klíčové pro ověření jejich primární struktury, detekci posttranslačních i umělých modifikací a pro zajištění kvality biokonjugovaných léčiv. Rychlé, citlivé a spolehlivé analýzy umožňují urychlit vývoj a výrobní procesy bioterapeutik a zabezpečit jejich bezpečnost a účinnost.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat vysokou propustnost a kvalitu peptidového mapování dvou komerčních monoklonálních protilátek (Rituximab a Denosumab) při použití ultrarychlého UHPLC systému Vanquish ve spojení s vysokorozlišeným Orbitrap™ Q Exactive™ HF hmotovým spektrometrem.

Použitá metodika a instrumentace

Příprava vzorků:

• Denaturace v 7 M ureu, redukce DTT, alkylace IAA, tryptická digestce přes noc.
• Ukončení digesce kyselinou trifluoroctovou (TFA).

Chromatografie:

• Thermo Scientific™ Vanquish™ UHPLC se 2.1×250 mm C18 kolonkou (Acclaim™ 120 C18).
• Gradient od 2 do 45 % acetonitrilu s 0,1 % kyseliny mravenčí.
• Časy gradientu: 30, 20, 13, 8 a 5 minut; průtoky 0,4–1,1 mL/min; tlak 600–1 300 bar.

Hmotová spektrometrie:

• Thermo Scientific™ Q Exactive™ HF s HESI-II zdrojem.
• Režim Full MS / dd-MS2 (Top5).
• Data akvizice Xcalibur™ 3.0 a Xcalibur™ SII 1.1.

Datová analýza:

• PepFinder™ 2.0 pro identifikaci a kvantifikaci modifikovaných peptidů.
• FreeStyle™ 1.0 pro vizualizaci a vyhodnocení spekter.

Hlavní výsledky a diskuse

• Všechny gradienty (5–30 min) dosáhly 100% sekvenčního pokrytí lehkého i těžkého řetězce Rituximabu.
• Šířka chromatografických píků pod 1 s i při 5min gradientu, průměrné PWHM ~1,4 s.
• Průměrně 6 Full MS a 25 MS/MS skenů na pík zajišťovalo dostatečný počet datových bodů.
• Relativní abundanční kvantifikace modifikací (oxidace, deamidace, glykozylace) byla konzistentní napříč všemi délkami gradientu (SD ~0,19 %).
• PepFinder 2.0 spolehlivě porovnával simulovaná a naměřená spektra, včetně nízkoabundantních glykopeptidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy až na 5 minut při zachování plné informativnosti.
• Vysoká robustnost a reprodukovatelnost díky optimalizované kombinaci kolony, konektorů a zdroje HESI-II.
• Umožnění vysokopropustného workflow pro kontrolu kvality a výzkumné účely v biotechnologickém i farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zrychlení analýz díky vývoji rychlejších orbitrapových analyzátorů a nových chromatografických materiálů.
• Automatizované platformy pro přípravu vzorků a integrace AI nástrojů pro pokročilou interpretaci dat.
• Aplikace těchto metod na komplexnější biologické matrice a nové třídy bioterapeutik (bispecifické protilátky, konjugáty).

Závěr

Studie prokázala, že kombinace Vanquish UHPLC a Q Exactive HF MS umožňuje rychlé, citlivé a vysoce reprodukovatelné peptidové mapování monoklonálních protilátek s plným sekvenčním pokrytím a přesnou kvantifikací modifikací i v ultra-kratkých gradientech.

Reference

• Zhang Z. Large-scale identification and quantification of covalent modifications in therapeutic proteins. Anal. Chem. 2009;81:8354–8364.
• Shah XG, Jiang G, Chen L, Zhang Z. LC-MS/MS peptide mapping with automated data processing for routine profiling of N-glycans in immunoglobulins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2014;25:999–1011.