LC-UV-MS Peptide Mapping Development for Easy Transfer to LC-UV QA/QC

Význam tématu

Peptidové mapování hraje klíčovou roli při charakterizaci bioterapeutik, zejména monoklonálních protilátek. Kombinace vysokorozlišené kapalinové chromatografie s UV a hmotnostní spektrometrií umožňuje přesné potvrzení primární struktury, lokalizaci posttranslačních modifikací a zajišťuje robustní kontrolu kvality v průmyslovém prostředí.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit vhodnost systému Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC ve spojení s Q Exactive HF MS pro vývoj spolehlivé a snadno přenositelné metody peptidového mapování do rutinních UV založených QC laboratoří. Analýza byla provedena na digesu monoklonální protilátky rituximab pomocí SMART Digest kitu.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: rituximab digesovaný SMART Digest kitem (imobilizovaný trypsin), štěpení při 70 °C po dobu 75 min.
• Redukce disulfidických vazeb: 5 mM TCEP při 60 °C, 30 min.
• Chromatografie: kolona Acclaim RSLC 120 C18 (2,1×250 mm, 2,2 μm), gradient 4–55 % organické fáze během 30 min, průtok 0,3 mL/min, teplota 50 °C, celková doba analýzy 56 min.
• Detekce: UV 214 nm (LightPipe 10 mm, 10 Hz) a současné snímání MS (Q Exactive HF, HESI-II zdroj).
• Software: Xcalibur 3.0 se Standard Instrument Integration, analýza dat v PepFinder 2.0.

Hlavní výsledky a diskuse

• Overlay UV a TIC chromatogramy pro jednoduché a spolehlivé přiřazení peptidů.
• Sekvenční pokrytí 99,2 % pro lehkou i těžkou řetězec, včetně různých intenzit peptidů a případů missed cleavages.
• Detekce a kvantifikace PTM jako deamidace, oxidace, pyro-Gln formace, glykanace na N301 a C-terminální Lys-varianty.
• Vysoká stabilita retencí díky biokompatibilnímu přívodu vzorku a předtlakování systému.

Přínosy a praktické využití metody

• Snadný přenos metody mezi výzkumnými a QC laboratořemi se standardní UV detekcí.
• Vysoce reprodukovatelné a rychlé štěpení vzorků SMART Digest kitem.
• Robustní workflow vhodné pro identifikaci, charakterizaci PTM a studium stability bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace přípravy vzorků a zpracování dat v QA/QC prostředí.
• Integrace umělé inteligence pro rychlejší a komplexnější interpretaci PTM.
• Vývoj nových kapalinově chromatografických fází pro vyšší rozlišení a kratší doby analýzy.
• Implementace kontinuálního sledování výrobních procesů (PAT).

Závěr

Studie potvrdila, že kombinace Vanquish Flex UHPLC, SMART Digest kitu a Q Exactive HF MS poskytuje citlivou, robustní a snadno přenositelnou platformu pro peptidové mapování monoklonálních protilátek s vysokým sekvenčním pokrytím a reprodukovatelností.

Reference

1. Thermo Scientific Technical Note 108: Reliable Solvent Mixing in UHPLC, 2011.
2. Thermo Scientific Oral Technical Presentation 71659: High Throughput Peptide Mapping with the Vanquish UHPLC System and the Q Exactive HF Mass Spectrometer, 2015.
3. Thermo Scientific Application Note 1132: Reliable Results in Peptide Mapping Using the Vanquish Flex UHPLC System, 2015.