High Throughput Peptide Mapping with the Vanquish UHPLC System and the Q Exactive HF Mass Spectrometer

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAbs) patří mezi nejrychleji se rozvíjející segment biofarmaceutik. Jejich kvalita a konzistence post-translačních modifikací (PTM) jsou klíčové pro účinnost, bezpečnost a regulační schválení léčiv. Rychlá a spolehlivá analýza PTM je nezbytná jak ve vývojových fázích, tak při rutinním monitoringu výrobních šarží.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat možnost vysokopropustného (high-throughput) peptide mappingu několika moderních mAb léčiv během pěti minut analýzy. Jako modelové proteiny byly vybrány komerčně dostupné přípravky rituximab (MabThera/Rituxan) a denosumab (Prolia/XGEVA). Studie se zaměřila na pokrytí sekvence, identifikaci N-glykanů a kvantifikaci hlavních PTM v ultra-rychlých chromatografických bězích.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly denaturovány v 7 M ureu s Tris-HCl pH 8, redukovány DTT, alkylovány IAA a enzymaticky štěpeny trypsinem přes noc při 37 °C. Nutnou instrumentací byly:

• UHPLC Vanquish s kolonkou Thermo Scientific Acclaim RSLC 120 C18 (2.1×250 mm, 2.2 µm)
• Gradienty vody/ACN s 0.1 % kyselinou mravenčí (5–30 min, průtok 1.1–0.4 mL/min)
• Orbitrap Q Exactive HF mass-spektrometr s HESI-II ionizačním zdrojem
• Softwarové nástroje Xcalibur 3.0, SII for Xcalibur 1.1, PepFinder 2.0 a FreeStyle 1.0

Hlavní výsledky a diskuse

• Všemi gradienty (5–30 min) bylo dosaženo 100% pokrytí aminokyselinové sekvence lehkého i těžkého řetězce pro oba analyzované mAb.
• Ultra-rychlé gradienty 5 min poskytly špičkovou účinnost separace (šířky PWHM <1 s) a dostatečný počet datových bodů (cca 30 skenů/běžku) pro spolehlivou identifikaci peptidů.
• Kvantifikace vybraných PTM (oxidace Met, deamidace Asn, heterogenita C-terminální Lys, N-glykanové varianty A2G0F, A2G1F, A2G2F aj.) ukázala konzistentní abundanci napříč všemi gradienty (RSD <5 %).
• Identifikace glykosidických peptidů vyžadovala optimalizaci HCD MS/MS podmínek pro kvalitní fragmentační spektra výhradně glykanových oxoniových iontů.

Přínosy a praktické využití metody

Rychlá LC-MS/MS platforma umožňuje:

• Významné zkrácení doby analýzy z desítek na jednotky minut při zachování úplného sekvenčního pokrytí.
• Vysokou propustnost pro screening mnoha vzorků během fáze výběru klonů a optimalizace výrobního procesu.
• Rychlý monitoring PTM během QA/QC kontrol i stability produktu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zrychlení pomocí:

• Kolonek s menšími částicemi a zkrácenými délkami běhu.
• Pokročilých iontizačních zdrojů a spektrometrů vyššího rozlišení a rychlosti skenování.
• Automatizovaných softwarových řešení pro real-time zpracování dat a prediktivní identifikaci PTM.

Závěr

Studie potvrzuje, že kombinace Vanquish UHPLC a Q Exactive HF MS poskytuje robustní, vysoce reprodukovatelnou metodu pro ultrarychlý peptide mapping mAb. Metoda dosahuje 100% sekvenčního pokrytí a spolehlivé kvantifikace PTM během 5–30 minut, což významně zvyšuje propustnost analýz v biopharma vývoji i výrobě.

Reference

1. Zhang Z., Large-scale identification and quantification of covalent modifications in therapeutic proteins. Anal. Chem. 2009, 81, 8354–8364.
2. Shah X.G., Jiang G., Chen L., Zhang Z., LC-MS/MS peptide mapping with automated data processing for routine profiling of N-glycans in immunoglobulins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2014, 25, 999–1011.