The importance of correct UHPLC instrument setup for protein aggregate analysis by size-exclusion chromatography

Význam tématu

Velmi přesná analýza agregátů bílkovin je kritická pro vývoj a výrobu bioterapeutik. Agregace monoklonálních protilátek může ovlivnit jejich účinnost i bezpečnost. Správné nastavení UHPLC systému a minimalizace předkolonní disperze je klíčové pro dosažení vysoké rozlišovací schopnosti a přesné kvantifikace agregátů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ukázat použití Thermo Scientific™ MabPac™ SEC-1 SEC kolony na stanovení agregátů monoklonálních protilátek při využití Vanquish™ Flex Quaternary UHPLC systému. Hlavními body byly:

• Porovnání chování kolon různých vnitřních průměrů (7,8 mm a 4,0 mm) při standardních a redukovaných průtocích.
• Vyhodnocení vlivu průměru předkolonních kapilár na šířku a tvar špiček.
• Analýza efektu injekčního objemu na rozlišení agregátů.
• Ověření vlivu přidání organického rozpouštědla (acetonitrilu) do mobilní fáze.

Použitá metodika a instrumentace

Monoklonální protilátka bevacizumab byla připravena v koncentraci 25 mg/mL v pufru 0,2 M NaCl / 100 mM fosfát pH 6,8 se 0–20 % acetonitrilu. Separace probíhala při teplotě 30 °C s UV detekcí na 214 nm. Pro studie disperze byly uvažovány kapiláry s vnitřním průměrem 180, 100, 75 a 50 µm.

Separační podmínky:

• Kolony MabPac SEC-1: 7,8×300 mm při 1,0 mL/min, 4,0×300 mm při 0,3 mL/min.
• Injekční objemy: 1 µL a 10 µL.
• Mobilní fáze: 0,2 M NaCl v 100 mM fosfátovém pufru, pH 6,8.
• Data: Chromeleon™ 7.2 SR2 CDS.

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex Quaternary UHPLC systém (VF-S01-A, VF-P20-A, VF-A10-A, VH-C10-A, VH-D10-A).
• LightPipe™ Flow Cell, 10 mm (P/N 6083.0100).
• Kolony MabPac SEC-1 7,8×300 mm (P/N 088460) a 4×300 mm (P/N 074696).
• Virtuoso™ Vial Identification System a širokohrdlé SureStop vialy.

Hlavní výsledky a diskuse

1) Předkolonní disperze: Kombinace 7,8 mm kolony a 1,0 mL/min byla vůči průměru kapilár nenáchylná. U 4 mm kolony při 0,3 mL/min však kapilára 180 µm způsobila nárůst šířky špiček z 0,26 na 0,38 min a zhoršení rozlišení agregátů. Nejlepší výkon poskytla kapilára 75 µm.

2) Objem injekce: Zvýšení injekčního objemu z 1 µL na 10 µL vedlo k rozšíření hlavní špičky a ztrátě definice menších agregátů. Pro SEC se doporučuje co nejnižší injekční objem při zachování citlivosti.

3) Přidání rozpouštědla: Ačkoli retenční časy a asymetrie zůstaly stabilní, 5 % acetonitrilu způsobilo snížení amplitudy špičky a mírné rozšíření. Při 20 % acetonitrilu došlo k významnému narušení tvaru špiček vlivem částečného denaturace proteinu.

Přínosy a praktické využití metody

• Optimalizace průměru předkolonní kapiláry a průtoku maximalizuje rozlišovací schopnost i citlivost SEC analýzy agregátů.
• Použití nízko-disperzního UHPLC systému jako Vanquish Flex zaručuje opakovatelné výsledky při nízkých průtocích.
• Provoz při nízkém objemu injekce minimalizuje předkolonní disperzi a zlepšuje rozlišení nízce zastoupených form agregátů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace SEC kolona a micro-UHPLC systémy pro snížení spotřeby vzorku a rozpouštědel.
• Automatizovaná kalibrace a inteligentní řízení předkolonní disperze pomocí umělé inteligence.
• Integrace dat z různých detekčních technik (MALS, DLS) pro komplexní charakterizaci agregací.

Závěr

Studie potvrdila, že pečlivý výběr průměru kapiláry, injekčního objemu a průtoku je pro SEC analýzu proteinových agregátů zásadní. Systém Vanquish Flex ve spojení s kolonou MabPac SEC-1 poskytuje vysoké rozlišení i citlivost při nízkých průtocích, aniž by bylo nutné přidávat organická rozpouštědla.

Reference

1. Grznárová G.; Polakovič M.; Ača P.; Görner T. Extra-column dispersion of macromolecular solutes in aqueous-phase SEC, Journal of Chromatography A, 1040(1), 33–43 (2004).
2. Hong P.; Koza S.; Bouvier E.S.P. Size exclusion chromatography for the analysis of protein biotherapeutics and their aggregates, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 35(20), 2923–2950 (2012).
3. Arakawa T.; Philo J.S.; Ejima D.; Tsumoto K.; Arisaka F. Aggregation analysis of therapeutic proteins, BioProcess International, 4(10), 42–43 (2006).