A universal chromatography method for aggregate analysis of monoclonal antibodies

Význam tématu

Analýza agregace monoklonálních protilátek (mAb) je klíčová pro zajištění bezpečnosti a účinnosti bioterapeutik. Agregáty mohou vyvolat nežádoucí imunitní reakce a ovlivnit stabilitu produktů během výroby, či skladování.

Cíle a přehled studie

Studie si kladla za cíl:

• Vyvinout jedinou globálně použitelnou metodu SEC pro analýzu pěti významných mAb.
• Zajistit symetrii špiček pro eliminaci sekundárních interakcí se stacionární fází.
• Dosáhnout dostatečného rozlišení monomeru a dimeru pro kvantifikaci agregátů.

Vybrané mAb (bevacizumab, cetuximab, infliximab, rituximab, trastuzumab) pokrývají různé struktury, pI a glykozylační vzorce.

Použitá metodika

Vzorky ve formulaci byly rekonstituovány vodou pro injekce. Analýza proběhla na sloupci MAbPac SEC-1 (7,8×300 mm) s mobilní fází 100 mM fosfátového pufru a 0,2 M NaCl (pH 6,8). Parametry:

• Průtok: 0,3 mL/min
• Teplota kolony: 25 °C
• Objem injekce: 1 µL
• Detekce: UV 214 nm

Použitá instrumentace

Vanquish Flex Quaternary UHPLC systém (Thermo Scientific) se split samplerem, quaternárním čerpadlem, sloupcovou komorou a DAD LightPipe.

Hlavní výsledky a diskuse

Všechny mAb vykázaly dobře rozlišené špičky monomeru a dimeru s minimálními posuny retence: cetuximab (tR 8,37 min), infliximab (8,40 min), trastuzumab (8,48 min), rituximab (8,66 min) a bevacizumab (8,84 min). Asymetrie se pohybovala mezi 1,07 a 1,13, pouze infliximab dosáhl 2,20. Míra agregace:

• Trastuzumab: 0,39 %
• Rituximab: 0,92 %
• Infliximab: 0,10 %
• Cetuximab: 0,29 %
• Bevacizumab: 2,99 %

Bevacizumab vykazuje nejvyšší komplexní agregaci, ostatní mAb nízké úrovně agregátů a fragmentů. Pořadí eluce odpovídá přibližně molekulové hmotnosti, s mírnou odchylkou u bevacizumabu způsobenou specifickou glykozylací.

Přínosy a praktické využití metody

MAbPac SEC-1 poskytuje univerzální, robustní a reprodukovatelnou platformu pro QC analýzu mAb agregace. Metoda minimalizuje sekundární interakce a umožňuje rychlou kvantifikaci agregátů v klinických a výrobních laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na nové formy bioterapeutik (bispecifické protilátky, konjugáty), integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní charakterizaci agregátů, snížení obsahu soli v mobilní fázi a automatizace přípravy vzorků.

Závěr

Studie prokázala, že MAbPac SEC-1 sloupec se společnou mobilní fází nabízí univerzální přístup k analýze agregace mAb s vysokým rozlišením, symetrií špiček a reprodukovatelnými výsledky.

Reference

• Hong P, Koza S, Bouvier ESP. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2012;35(20):2923–2950.
• Arakawa T, Philo JS, Ejima D, Tsumoto K, Arisaka F. Aggregation Analysis of Therapeutic Proteins. BioProcess International. 2006;4(10):42–43.
• Rao S, Pohl C. Reversible interference of Fe3+ with monoclonal antibody analysis in cation exchange columns. Analytical Biochemistry. 2011;409:293–295.
• Thermo Fisher Scientific. Application Note AN21602: The Importance of Correct UHPLC Instrument Setup for Protein Aggregate Analysis by Size-Exclusion Chromatography. 2016.