Comparability Studies for the Analysis of Nucleotides on Four Different LC Systems

Význam tématu

Fosforylované sloučeniny, zejména nukleotidy, představují v kapalinové chromatografii náročné analyty kvůli silným interakcím s kovovými částmi chromatografických systémů. Nesymetrické tvary píku a ztráty vzorku snižují kvalitu měření a spolehlivost výsledků. Nasazení nízkoadsorpčních (bio-inertních) systému eliminuje potřebu časově náročných pasivačních procedur, zvyšuje reprodukovatelnost a prodlužuje životnost zařízení.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat čtyři různé LC systémy Agilent z hlediska tvaru píku, ztráty vzorku a opakovatelnosti měření při analýze adenosinu a tří fosforylovaných derivátů (AMP, ADP, ATP). Analyty byly separovány na stejném PEEK-lemovaném HILIC sloupci za jednotných podmínek a čtyřikrát opakováno.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda: gradientní HILIC s mobilními fázemi obsahujícími 10 mM amonium acetát (pH 9) a acetonitril, tok 0,4 mL/min, teplota 35 °C, detekce UV při 260 nm.
Vzorky: ekvimolární směs adenosinu (80–400 µM) a jeho nukleotidů v čerstvě připravených roztocích, chlazeno na 10 °C.
Instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC: bio-inertní pumpa G5654A, multisampler G5668A (termostat), multicolumn thermostat G7116A, DAD WR G7115A.
• Agilent 1260 Infinity II Prime Bio LC: bio-flex pumpa G7131C, multisampler G7137A (termostat), multicolumn thermostat G7116B, VWD G7114B.
• Agilent 1290 Infinity II LC (stainless steel): flexibilní pumpa G7104A, multisampler G7167B, multicolumn thermostat G7116B, VWD G7114B.
• Agilent 1260 Infinity II LC (stainless steel): kvaternární pumpa G7111B, multisampler G7167A, multicolumn thermostat G7116A, VWD G7114B.

Hlavní výsledky a diskuse

Bio-inertní systémy (1260 Bio-Inert a Prime Bio) poskytly ostré, symetrické píky všech čtyř sloučenin s velmi nízkým RSD pro retenční časy i plochy. Na stainless steel systémech došlo u fosforylovaných nukleotidů k výraznému ozubení, protažení píku a ke ztrátám vzorku až nad 80 % pro ATP při nízkých koncentracích. Ztráty se s rostoucí koncentrací snižovaly, avšak zůstávaly významné. U bio-inertních přístrojů byly tyto jevy eliminovány, přičemž systém MP35N (Prime Bio) poskytl výkon srovnatelný s plně bio-inertním provedením.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace pasivačních procedur a zrychlení workflow.
• Vysoká reprodukovatelnost a stabilita analýzy fosforylovaných látek.
• Omezení ztrát vzorku, klíčové pro nízkokoncentrační aplikace ve farmaceutickém výzkumu a QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Bio-inertní chromatografické systémy se mohou uplatnit při analýze dalších kovově citlivých sloučenin, například glykanů, peptidů a lipidů. Další optimalizace mobilních fází a materiálů kapilár může přinést další zlepšení citlivosti a životnosti. Kombinace s hmotnostní detekcí otevře široké pole aplikací v proteomice a metabolomice.

Závěr

Porovnání ukázalo, že použití nízkoadsorpčních LC systémů zamezuje nežádoucím interakcím fosfátových skupin s kovovými částmi, což vede k přesným, reprodukovatelným a efektivním analýzám nukleotidů bez ztrát vzorku. Systémy Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert a Prime Bio se jeví jako optimální volba pro biofarmaceutickou analytiku.

Reference

1. Wakamatsu A.; Morimoto K.; Kudoh S. A Severe Peak Tailing of Phosphate Compounds Caused by Interaction with Stainless Steel Used for Liquid Chromatography and Electrospray Mass Spectrometry. J. Sep. Sci. 2005, 28, 1823–1830.
2. Fekete S. Defining Material Used in Biopharmaceutical Analysis. LCGC Europe 2021, 34, 245–248.
3. Agilent Technologies. HPLC-DAD Analysis of Nucleotides Using a Fully Inert Flowpath. Application Note 5994-0680EN, 2019.
4. Tuytten R. et al. Stainless Steel Electrospray Probe: a Dead End for Phosphorylated Organic Compounds? J. Chromatogr. A 2006, 1104, 209–221.
5. Hsiao J. J. et al. Improved LC/MS Methods for the Analysis of Metal-Sensitive Analytes Using Medronic Acid as a Mobile Phase Additive. Anal. Chem. 2018, 90(15), 9457–9464.
6. Heaton J. C.; McCalley D. V. Some Factors that Can Lead to Poor Peak Shape in Hydrophilic Interaction Chromatography, and Possibilities for Their Remediation. J. Chromatogr. A 2016, 1427, 37–44.