HPLC-DAD Analysis of Nucleotides Using a Fully Inert Flowpath - Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC System and a PEEK-lined Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z Column

Význam tématu

Phosphorylované sloučeniny, zejména nukleotidy, hrají klíčovou roli v biologických procesech a jejich spolehlivá chromatografická analýza je nezbytná pro výzkum i průmyslové aplikace. Interakce fosfátových skupin s kovovými částmi chromatografických systémů vede k rozšířeným a zkresleným píkům či ztrátě signálu, což ztěžuje kvantifikaci a kvalifikaci těchto látek.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie je demonstrovat analýzu nukleotidů na plně inertním chromatografickém systému bez kovových komponent ve flowpath. Použit byl Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC System v kombinaci s PEEK-lined Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z kolonkou, přičemž byly porovnány výsledky s konvenčním systémem se nerezovými částmi.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda: HILIC-DAD analýza nukleosidů a nukleotidů při vlnové délce 260 nm.

• Přístroj: Agilent 1260 Infinity II Bio-Inert LC System
• Kolonka: PEEK-lined InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z (2,1×100 mm, 2,7 μm)
• Mobilní fáze A: 10 mM NH4-acetát, pH 9
• Mobilní fáze B: acetonitril/100 mM NH4-acetát pH 9 (90:10, v/v)
• Gradient: 0–12 min z 90 na 48 % B; 12–13 min udržení 48 % B; 13–13,1 min návrat na 90 % B; 13,1–22 min stabilizace
• Průtok: 0,4 mL/min; teplota kolony: 35 °C; injekční objem: 1 μL
• Detekce: diode array detector (DAD), 260 nm, šířka pásma 4 nm

Hlavní výsledky a diskuse

Na plně inertním systému byly u všech nukleotidů dosaženy symetrické píky a vysoké procento obnovy (>95 % pro nukleosidy, 82–110 % pro nukleotidy) s nízkou variabilitou (RSD retence <0,05 %, RSD plochy <1,0 %). Naopak konvenční nerezový systém vykazoval zhoršenou obnovu a výrazné roztahování píků, přičemž s rostoucím počtem fosfátů klesala důvěryhodnost kvantifikace.

Přínosy a praktické využití metody

• Eliminace kov-fosfátových interakcí zvyšuje citlivost a přesnost analýzy nukleotidů
• Vysoká reprodukovatelnost a robustnost metody vhodná pro rutinní QC/QA
• Možnost rozšíření na další fosforylované biomolekuly (peptidy, glykany)

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se zaměří na integraci plně inertních systémů s hmotnostní spektrometrií pro komplexní biomolekulární analýzu, optimalizaci povrchových úprav sloupců a aplikace ve farmaceutickém i biotechnologickém sektoru pro monitorování metabolitů a studium signálních drah.

Závěr

Štěpení fosfátových skupin na kovových površích lze účinně překonat použitím plně inertního LC systému a PEEK-lined HILIC kolony. Tato kombinace zajišťuje symetrické píky, vysokou obnovu a nízkou variabilitu analýzy nukleotidů.

Reference

1. Wakamatsu A. et al. A Severe Peak Tailing of Phosphate Compounds Caused by Interaction with Stainless Steel Used for Liquid Chromatography and Electrospray Mass Spectrometry. J. Sep. Sci. 2005, 28(14):1823–1830.
2. Liu S. et al. Formation of Phosphopeptide-Metal Ion Complexes in LC/ESI-MS and Their Influence on Phosphopeptide Detection. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005, 19(19):2747–2756.
3. Tuytten R. et al. Stainless Steel Electrospray Probe: a Dead End for Phosphorylated Organic Compounds? J. Chromatogr. A 2006, 1104:209–221.
4. Asakawa Y. et al. Suppression Effects of Carbonate on the Interaction Between Stainless Steel and Phosphate Groups in HPLC-ESI-MS. J. Chromatogr. A 2008, 1198–1199:80–86.
5. Sakamaki H. et al. Evaluation of Column Hardware on LC-MS of Phosphorylated Compounds. J. Chromatogr. A 2015, 1381:125–131.
6. Schneider S. Analysis of Phosphate Compounds with the Agilent 1260 Infinity Bio-Inert Quaternary LC System. Agilent Tech. App. Note 2012, pub. 5991-0025EN.
7. Sandra K., Vandenbussche J., Sandra P. Analyzing Phosphorylated N-Glycans with Full Recovery on Bio-Inert LC Systems and PEEK-Lined HILIC Columns. LCGC 2018, 31(10):566–571.
8. Hsiao J. J. et al. Improved LC/MS Methods for Metal-Sensitive Analytes Using Medronic Acid as Mobile Phase Additive. Anal. Chem. 2018, 90:9457–9464.