Demonstrating Inertness for the Analysis of Nucleotides on the Agilent 1290 Infinity II Bio LC

Význam tématu

Chromatografická inertnost je klíčová pro přesnou analýzu kovově citlivých sloučenin, zejména nukleotidů s fosfátovými skupinami. Nechtěná adsorpce na kovové povrchy vede k deformacím tvaru píků, snížené reprodukovatelnosti a ztrátě analytu.

Cíle a přehled studie

Studie si kladla za cíl demonstrovat nízkoadsorpční vlastnosti systému Agilent 1290 Infinity II Bio LC při analýze nukleotidů. Jako modelový vzorek byla použita ekvimolární směs adenosinu a nehydrolyzovatelného ADP analogonu AMPcP. Poměřováním poměru ploch píků obou látek lze kvantifikovat případnou interakci s kovovými částmi chromatografu.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC: pumpa G7131A, multisampler G7137A se vzorkovacím termostatem, multikolonový termostat G7116B, detektor proměnné vlnové délky G7114B
• Kolona ACQUITY PREMIER HSS T3 (1,8 µm, 2,1 × 50 mm, č. dílu 186009467)
• Software Agilent OpenLab CDS verze 2.6 a vyšší

Použitá metodika

Vzorek obsahoval 3,400 µg AMPcP (7,6 nmol) a 2,140 µg adenosinu (8 nmol) ve 200 µL vody. Mobilní fáze:

• Fáze A: 10 mM acetát amonný ve vodě
• Fáze B: 90 % acetonitril, 10 % voda, 10 mM acetát amonný, 0,1 % TFA

Gradient: 0–3 min 5→95 % B, stop time 3 min, reequilibrace 5 min; průtok 0,4 mL/min; teplota kolony 35 °C; detekce při 260 nm, 20 Hz; injekční objem 1 µL; teplota vzorku 10 °C; proplach jehly 3 s ve vodě.

Hlavní výsledky a diskuse

Při pěti po sobě jdoucích injekcích dosahoval průměrný poměr ploch AMPcP/adenosin 0,95 ± 0,01. Relativní odchylka retence (RSD RT) byla nižší než 0,1 % a plošné RSD nižší než 0,5 %, což potvrzuje vysokou reprodukovatelnost a minimální adsorpci na kovové povrchy.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí robustní nízkoadsorpční výkon, který zajišťuje spolehlivou analýzu fosforylovaných biomolekul v QC laboratořích, biotechnologii a farmaceutickém výzkumu. Snižuje potřebu časté údržby a korekce dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření analýzy na další fosfátové biomolekuly, peptidy a oligonukleotidy
• Kombinace s hmotnostní spektrometrií pro komplexní bioanalytické aplikace
• Vývoj nových povrchových úprav a materiálů pro další snížení interakcí
• Implementace do vysokoprůtokových a automatizovaných chromatografických platforem

Závěr

Agilent 1290 Infinity II Bio LC prokázal vynikající inertnost při analýze kovově citlivých nukleotidů. Systém dosahuje vysoké reprodukovatelnosti a spolehlivosti dat bez výrazné adsorpce, což umožňuje důvěryhodné výsledky v biochromatografii.

Reference

• Wakamatsu A. et al. A Severe Peak Tailing of Phosphate Compounds Caused by Interaction with Stainless Steel Used for Liquid Chromatography and Electrospray Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Applications in Separation Sciences. 2005;28(14):1823–1830.
• Fekete S. Defining Material Used in Biopharmaceutical Analysis. LCGC Europe. 2021;34(6):245–248.
• Schneider S. Comparability Studies for the Analysis of Nucleotides on Four Different LC Systems. Agilent Technologies application note. 2021;5994–4392EN.
• Patel A. et al. PREMIER Standards to Investigate the Inertness of Chromatographic Surfaces. Waters Corporation application note. 2021;720007105EN.