Quantification of 25-hydroxyvitamin D2 and D3 in human plasma by LC-HRAM-MS for clinical research

Význam tématu

Vitamin D hraje klíčovou roli v regulaci homeostázy vápníku a fosfátů a ovlivňuje imunitní funkce. Měření 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 je zásadní pro diagnostiku nedostatku vitaminu D, který je spojen s metabolickými kostními onemocněními, kardiovaskulárními chorobami, rakovinou a autoimunitními poruchami.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a analyticky validovat metodiku pro kvantifikaci 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v lidské plazmě využívající LC-HRAM-MS (Orbitrap Exploris 120) v kombinaci s Vanquish Flex UHPLC. Hodnotily se parametry linearity, LLOQ, přesnosti, zjišťování nesnášenlivosti (carryover) a reprodukovatelnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: 50 µL plazmy, přídavek interního standardu d6-25-OHD3, precipitace bílkovin 150 µL acetonitrilu, vortex, centrifugace, transfer supernatantu.
Chromatografie: Hypersil GOLD 2.1×50 mm (1.9 µm), 40 °C, tok 0,5 mL/min, 3,5 min; mobilní fáze A – 5 mM ammonium formát + 0,1 % formiová kyselina ve vodě; B – 5 mM ammonium formát + 0,1 % formiová kyselina v methanolu; gradient 80→100→80 % B.
Hmotová spektrometrie: APCI pozitivní ionizace; Full Scan MS 60 000 FWHM (m/z 100–500); tMS2 30 000 FWHM, HCD CE 40 %; analýza v TraceFinder 5.1.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Flex Binary
• Kolona: Hypersil GOLD 2.1×50 mm, 1.9 µm
• MS: Thermo Scientific Orbitrap Exploris 120
• Ionizace: APCI v pozitivním módu
• Software: Thermo Scientific TraceFinder 5.1

Hlavní výsledky a diskuse

Calibration: kvadratická křivka s 1/x vážením, bias ≤ ±10 %. LLOQ ve Full Scan i tMS2 režimu: 25-OHD2 = 1,97 µg/L, 25-OHD3 = 4,52 µg/L. Intra-assay %CV < 7,5 % (Full Scan) a < 8,4 % (tMS2); inter-assay %CV < 5,0 % (Full Scan) a < 5,9 % (tMS2). Carryover zanedbatelné.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a jednoduchá offline precipitace bílkovin
• Vysoká selektivita a citlivost díky HRMS
• Vhodné pro klinický výzkum i rutinní monitoring vitaminu D

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další metabolity vitaminu D
• Integrace do vysokopropustných (high-throughput) platforem
• Automatizace přípravy a pokročilá datová analýza

Závěr

Vyvinutá LC-HRAM-MS metodika pro kvantifikaci 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v lidské plazmě je robustní, citlivá a přesná, splňuje požadavky klinického výzkumu a výrazně zefektivňuje laboratorní workflow.

Reference

1. Mora JR, Iwata M, von Andrian UH. Vitamin effects on the immune system: vitamins A and D take centre stage. Nat Rev Immunol. 2008;8:685-698.
2. Plum LA, DeLuca HF. Vitamin D, disease and therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2010;9:941-955.
3. DeLuca HF. The vitamin D story: a collaborative effort of basic science and clinical medicine. FASEB J. 1988;2:224-236.
4. Holick MF. Vitamin D Deficiency. N Engl J Med. 2007;357:266-281.
5. Ohyama Y, Yamasaki T. Eight cytochrome P450s catalyze vitamin D metabolism. Front Biosci. 2004;9:3007-3018.