Quantification of 25-hydroxyvitamin D2 and D3 in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for clinical research

Význam tématu

Správná kvantifikace 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v lidské plasmě je klíčová pro klinický výzkum zaměřený na diagnostiku a sledování různých onemocnění kostí, imunitního systému či kardiovaskulárních a autoimunitních poruch. Díky dlouhé poločasu 25-hydroxyvitaminu D (~3 týdny) poskytuje jeho měření stabilní obraz zásob vitaminu D v organismu.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyvinout a ověřit robustní, citlivou a rychlou metodu pro kvantifikaci 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v lidské plasmě za účelem klinického výzkumu. Metoda kombinuje offline srážení proteinů s online SPE (solid phase extraction) a LC-MS/MS, využívá komerční připravený kit ClinMass® pro optimalizovanou přípravu vzorků a je implementována na systému Thermo Scientific™ Transcend™ II TLX-2 spojeném s TSQ Quantis™ triple kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Příprava vzorku: 50 µl plasmy, přidání deuterovaného interního standardu d6-25-hydroxyvitamin D3, proteinová srážecí činidla podle ClinMass® kitu.
• Offline srážení a extrakce: Vzorky byly vířeny, inkubovány při 4 °C, centrifugovány a supernatant přenesen pro další analýzu.
• Online SPE a LC: Systém Transcend II TLX-2 využívá SPE patronu a analytický kolonu z kitu RECIPE, gradientní eluce v celkovém čase 3,0 minuty.
• Detekce: APCI v pozitivním módu, SRM (vybrané reakční monitorování) se dvěma přechody pro každý analyti a interní standard.
• Vyhodnocení: Lineární interpolace s vážením 1/x, akceptační kritéria přesnosti bias ±10 %, intra- a inter-denní přesnost %CV ≤2,8.

Instrumentace:

• Liquid chromatography: Thermo Scientific Transcend II TLX-2 systém s online SPE.
• Analytická kolona a SPE patrona: RECIPE Chemicals + Instruments GmbH.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific TSQ Quantis triple kvadrupólový MS s APCI zdrojem.
• Softwarové zpracování: Thermo Scientific TraceFinder 4.1.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda vykázala lineární odezvu v rozsahu 9–81 ng/ml pro D2 a 9–79 ng/ml pro D3 s biasem mezi –5,5 % až –1,7 %. Intra-denní variabilita (%CV) nepřekročila 2,4 %, inter-denní variabilita dosáhla maximálně 2,8 %. Přechodové chromatogramy nejnižšího kalibrátoru potvrdily dostatečnou citlivost a absenci významného carryover.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Rychlou analýzu (3 min/run) pro vysokou průchodnost vzorků.
• Vysokou přesnost a reprodukovatelnost díky komerčně standardizovanému kitu a optimalizované SPE.
• Spolehlivou kvantifikaci s nízkým rušením matricí díky APCI zdroji.

Výsledný protokol je vhodný pro klinické výzkumné laboratoře zaměřené na nutriční studie, endokrinologii a epidemiologii.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj automatizované přípravy vzorků a ještě vyšší integrace online extrakce s kapilárními LC systémy. Kombinace s vysoce rozeznávacími orbitrapovými hmotnostními spektrometry by mohla rozšířit rozsah sledovaných metabolit vitaminu D a jejich konjugátů. Metoda může být adaptována i pro multiplexní analýzy souběžného stanovení dalších vitamínů a steroidů.

Závěr

Popsaná metoda pro kvantifikaci 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 v lidské plasmě je rychlá, citlivá a vysoce reprodukovatelná. Využití standardizovaného kitu, online SPE a triple kvadrupólového MS zajišťuje splnění nároků klinického výzkumu v oblasti výživy a onemocnění spojených s deficitem vitaminu D.

Reference

• De Nardi C., Brambilla P., Brambilla M., Fania C. Quantification of 25-hydroxyvitamin D2 and D3 in human plasma by LC-MS/MS. Technical Note 65471, Thermo Fisher Scientific, 2019.