Activated-Ion Electron Transfer Dissociation Enables Electron-Based Dissociation Following Proton Transfer Charge Reduction

Význam tématu

Analýza intact proteinů metodami top-down proteomiky vyžaduje kombinaci vysoké rozlišovací schopnosti a účinné fragmentace. Proton transfer charge reduction (PTCR) umožňuje jasné rozdělení složitých nabitostních obalů proteinů, avšak vede k nízké hustotě náboje, která významně omezuje účinnost klasického electron transfer dissociation (ETD). Activated-ion ETD (AI-ETD) překonává tuto nevýhodu současným IR zahřátím iontů, čímž obnovuje efektivitu elektronové fragmentace i u nízce nabitých proteinových iontů.

Cíle a přehled studie / článku

Tato práce si klade za cíl demonstrovat využitelnost AI-ETD pro fragmentaci intact proteinů po PTCR a porovnat její výkonnost se standardní ETD. Konkrétně autoři:

• Provedli charge-reduction vybraných bílkovin (apomyoglobin, karboanhydráza, enoláza) metodou PTCR.
• Porovnali sekvenční pokrytí získané pomocí ETD a AI-ETD na Orbitrap Eclipse mass spektrometru.
• Vyhodnotili vliv IR laserového výkonu na výtěžnost fragmentních iontů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky bílkovin byly připraveny v 60 % vodě, 40 % acetonitrilu, 0,1 % kyseliny mravenčí. Po PTCR izolaci hlavního nabitostního stavu následovala fragmentace buď klasickou ETD, nebo AI-ETD s současným IR ozářením. Spektra byla zaznamenána v Orbitrapu při rozlišení 240 000 a vyhodnocena softwarem TDValidator s tolerancí do 20 ppm.

Hlavní výsledky a diskuse

Stand-alone ETD po PTCR generuje zanedbatelné množství c a z• fragmentů, což se projevuje sekvenčním pokrytím <1 %. U AI-ETD došlo k dramatickému nárůstu pokrytí (např. apomyoglobin z <1 % na 82 %). Navíc se objevily i b/y ionty, což naznačuje nízkou úroveň IRMPD při použitých parametrech. Optimalizace laserového výkonu odhalila rovnováhu mezi zahřátím a vedlejšími disociačními procesy.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje plné využití electron-based dissociation pro intact proteiny po PTCR.
• Významně zlepšuje citlivost a sekvenční informace u nízkých nábojových stavů.
• Rozšiřuje možnosti analýzy komplexních proteinových směsí v průmyslové QA/QC i výzkumných laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zlepšení PTCR pomocí technik jako ion parking, which will concentrate ion current. Integrace AI-ETD s moderními top-down přístupy a vyšším rozlišením spekter nabídne hlubší proteomické mapování a analýzu post-translačních modifikací.

Závěr

AI-ETD představuje efektivní řešení pro fragmentaci nízce nabitých intact proteinů po PTCR, obnovuje vysoké sekvenční pokrytí a otevírá nové možnosti pro detailní top-down proteomiku.

Reference

1. Huguet R et al. (2019). Anal. Chem., 91(24), 15732–15739.
2. Stephenson JL, McLuckey SA. (1996). J. Am. Chem. Soc., 118(31), 7390–7397.
3. Ugrin SA et al. (2019). J. Am. Soc. Mass Spectrom., 30(10), 2163–2173.
4. Riley NM, Coon JJ. (2018). Anal. Chem., 90(1), 40–64.
5. Riley NM, Westphall MS, Coon JJ. (2017). J. Proteome Res., 16(7), 2653–2659.
6. McLuckey SA, Reid GE, Wells JM. (2002). Anal. Chem., 74(2), 336–346.