Advancing native top-down MS analysis of non-covalent protein complexes: The Thermo Scientific Q Exactive UHMR mass spectrometer

Význam tématu

Native hmotnostní spektrometrie a top-down přístupy nabízejí jedinečnou možnost studia biologických makromolekul v jejich přirozeném složeném stavu. Umožňují zachovat nevazebné interakce protein-ligand i složité heteromerické komplexy, čímž přispívají k porozumění jejich struktuře, dynamice a funkci. Tyto metody se stávají nepostradatelné v oblasti strukturální proteomiky, farmaceutického výzkumu a vývoje biotechnologických produktů.

Cíle a přehled studie

Studie představuje technologické inovace v instrumentu Thermo Scientific Q Exactive UHMR umožňující native top-down pseudo-MS3 analýzu ne-kovalentních proteinových komplexů. Hlavními cíli byly: identifikovat vylepšení hardware a software, demonstrovat zachycení a fragmentaci velkých komplexů (GroEL, 20S proteasom, membránové proteiny AmtB a LmrP) a vyhodnotit citlivost, rozlišení a přesnost monoisotopické hmotnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Využitá technologie: Hybridní kvadrupól-Orbitrap Thermo Scientific Q Exactive UHMR.
Klíčové modifikace:

• In-source trapping: pulzní zachycení a řízená desolvace iontů v injekčním flatapolu.
• Snížení RF frekvencí ve všech multipólech pro zvýšení přenosu vysokých m/z iontů.
• Rozšířený rozsah kvadrupólu až do m/z 25 000.
• Zvýšené energie HCD až na 300 V.
• Optimalizace plynného tlaku a rychlosti rampy vysokého napětí v Orbitrapu.

Hlavní výsledky a diskuse

1. GroEL 14-mer: In-source trapping úspěšně rozložilo komplex na monomery, 13-mer a 12-mer. Pseudo-MS3 fragmentace monomeru odhalila 112 b a y iontů (21 % rozštěpů reziduí).
2. Rabbit 20S proteasom: Native MS1 ukázala čtyři heptamerické kruhy. MS2 s in-source trappingem identifikovala šest z 7 alfa subjednotek s isotopickým rozlišením (R=200 000). Pseudo-MS3 na izolovaném alfa-6 (16+) potvrdilo přesnou monoisotopickou hmotnost (<3 ppm) a sekvenční informace.
3. Membránový komplex AmtB: Efektivní odstranění detergentů in-source trappingem přineslo monomerní m/z rozdělovač a top-down sekvenování vedlo k 75 b/y iontům (19 % rozštěpů) s nízkoppm odchylkou.
4. Membránový transporter LmrP: Optimalizace desolvace umožnila uvolnění LmrP a top-down fragmentaci, což vedlo k identifikaci 104 b/y iontů (33 % rozštěpů).

Přínosy a praktické využití metody

Native top-down pseudo-MS3 na Q Exactive UHMR nabízí:

• Vysokou citlivost při menším objemu vzorku.
• Špičkové rozlišení a přesnost pro monomolekulární hmotu velkých komplexů.
• Možnost studia heteromerických a membránových komplexů bez potřeby stabilizujícího přenosu do pevného stavu.
• Rychlé získání sekvenčních informací z izolovaných subjednotek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření hmotnostního rozsahu a citlivosti, vylepšená automatická izolace subjednotek a integrace s iontovou mobilitou. Kombinace s dalšími strukturálními metodami (kryo-EM, NMR) a využití v analýze biologických léčiv, kvalitativní kontrole a personalizované medicíně přinese nový vhled do dynamiky proteinových komplexů a jejich funkcí in vivo.

Závěr

Thermo Scientific Q Exactive UHMR posouvá hranice native MS a top-down analýzy díky technickým vylepšením, která umožňují studovat velké, nevazebné a membránové proteinové komplexy s vysokou citlivostí, rozlišením a hmotnostní přesností. Pseudo-MS3 přístupy otevírají cestu k detailnímu mapování sekvenčních informací a strukturní charakterizaci komplexních biologických systémů.

Reference

• Belov M.E. a kol. Anal. Chem. 2013, 85(23), 11163–11173.
• Ben-Nissan G. a kol. Anal. Chem. 2017, 89(8), 4708–4715.
• van de Waterbeemd M. a kol. Nat. Methods 2017, 14(3), 283–286.
• Fort K.L. a kol. Analyst 2017, 143(1), 100–105.
• Viner R. a kol. IMSC 2018, Florence, WPS-S01.