Robust Lipidomic Profiling to Routinely Quantitate Ceramides and Confidently Identify Unknown Lipids

Význam tématu

Fetální bovinní sérum (FBS) se široce využívá jako klíčový doplněk buněčných kultur díky obsahu živin, hormonů a lipidů. Ceramidy jsou důležitou složkou membrán a regulátorem buněčné signalizace, apoptózy a stresových reakcí. Přesná a rutinní kvantifikace ceramidů je proto nezbytná pro zajištění reprodukovatelnosti experimentů v biotechnologii, farmaceutickém výzkumu a kvalitativní kontrole buněčných produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout robustní cílenou lipidomickou metodu pro kvantitativní stanovení čtyř vybraných ceramidů v FBS a současně umožnit identifikaci neznámých lipidů. Autoři rovněž sledovali, jak různé ošetření vzorků (dialýza, ohřev) a původ FBS ovlivňují obsah ceramidů a dalších lipidů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a detekci lipidu byla použita kapalinová chromatografie vysokého rozlišení (UHPLC) a hmotnostní spektrometrie Orbitrap Exploris 120 s elektrosprejovou ionizací (ESI). Klíčové prvky:

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Flex s kolonkou Accucore C18 (2,1 × 150 mm, 2,6 µm) při 45 °C.
• Fáze mobilní: směsi acetonitrilu, isopropanolu a vodného roztoku HCOONH4/HCOOH.
• MS detekce: střídavé módy Full-MS (250–1600 Da) a selektivního iontového monitorování (SIM) pro zvýšenou citlivost.
• DD-MS/MS: datově řízená MS/MS akvizice v pozitivním i negativním módu pro neznámou lipidomiku.
• Interní standardy: deuterované ceramidy (D7-Cer d18:1/16:0, d18:1/18:0, d18:1/24:1, d18:1/24:0).
• Softwarové zpracování: Xcalibur pro akvizici, TraceFinder pro kvantifikaci a LipidSearch pro anotaci lipidů.

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární kalibrační křivky pokrývaly rozsah od 0,1–0,25 do 10 000 ng/mL s R2 > 0,99 a CV ≤ 20 % na všech hladinách. Mezi-injekční variabilita retenčních časů deuterovaných IS byla CV < 0,1 % a CV integrovaných ploch v FBS vzorcích činila ≤ 5,2 %. Koncentrace čtyř ceramidů v různých FBS šaržích se pohybovaly v rozmezí 10–150 ng/mL, přičemž rozdíly mezi vzorky dosahovaly až desítek procent, ale nebyla prokázána statisticky významná závislost na původu či ošetření FBS. Retrospektivní analýza Full-MS dat odhalila u dvou lyso-fosfolipidů (LPC) signifikantní snížení odezvy po dialýze, zatímco u příbuzných PC lipidů k žádné změně nedošlo.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje citlivé a reprodukovatelné stanovení ceramidů v komplexních biologických matricích. Současná akvizice SIM pro cílenou kvantifikaci a Full-MS pro retrospektivní lipidomiku zvyšuje efektivitu laboratorního workflow a poskytuje komplexní lipidový profil pro QA/QC a výzkumné aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na širší spektrum lipidových tříd (sfingomyeliny, triacylglyceridy apod.).
• Integrace s pokročilými algoritmy pro zpracování dat a strojové učení pro přesnější anotaci neznámých lipidů.
• Standardizace kontroly kvality FBS šarž pomocí rutinní lipidomické analýzy.
• Vývoj automatizovaných postupů pro rychlou přípravu vzorků a zpracování výsledků.

Závěr

Studie představila robustní a rutinně použitelnou metodu pro kvantifikaci čtyř klíčových ceramidů v FBS s vysokou reprodukovatelností a citlivostí. Současná akvizice SIM a Full-MS umožňuje vedle cílené analýzy také retrospektivní neznámou lipidomiku. Pozorované variace ceramidů nebyly ovlivněny původem ani ošetřením FBS, zatímco dialýza redukovala množství některých malých lipidů.

Reference

1. Ruzicka J, Souza A, Amer B. Robust Lipidomic Profiling to Routinely Quantitate Ceramides and Confidently Identify Unknown Lipids. Thermo Fisher Scientific; 2021.