PREHĽAD ANALYTICKÝCH METÓD NA STANOVENIE POLYÉTEROVÝCH ANTIBIOTÍK

Význam tématu

Polyéterová antibiotika, zejména salinomycin, monenzin, narazin a lasalocid, představují důležitou skupinu ionoforů využívaných ve veterinární medicíně pro léčbu kokcidiózy a jako stimulátory růstu hospodářských zvířat. Jejich úzký terapeutický index a možná akumulace reziduí v krmivech či živočišných produktech zdůrazňují potřebu spolehlivých analytických metod pro jejich detekci a kvantifikaci na úrovních od mg/kg po ng/kg.

Cíle a přehled článku

Článek shrnuje hlavní analytické přístupy používané k identifikaci a stanovení polyéterových antibiotik v různých matricích: mikrobiologické testy, spektrofotometrie, tenkovrstvá chromatografie (TLC), vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC) včetně derivatizace a hmotnostní detekce, a imunochemické testy (ELISA). Popisuje jejich principy, výhody, limity a příklady aplikací na krmiva, premixy, produkty živočišného původu a fermentační půdy.

Použitá instrumentace

• Mikrobiologické platové a turbidimetrické inkubátory
• UV-VIS spektrofotometr
• Tenkovrstvové chromatografické komory a bioautografické stanovení
• HPLC systémy s reverzními kolonami C8/C18
• Přídavné moduly pro pokolónovou derivatizaci (pumpa reagentu, teplotní cely)
• Fluorescenční a refraktometrické detektory
• LC-MS/MS rozhraní s elektrospraye ionizací
• Immunoassay mikrotitrační čtečky (spektrofotometrické, fluorescenční, chemiluminiscenční)

Použitá metodika a instrumentace

Metodiky zahrnují mikrobiologické difúzní a turbidimetrické testy na Bacillus subtilis či Streptococcus faecalis, spektrofotometrické reakce polyéterů s vanilinem (Komarovský test), TLC s bioautografií a chemickou detekcí vanilinem, HPLC na reverzních C18/C8 kolónách s UV detekcí, pokolónovou derivatizací aldehydy (vanilin, DMABA) a fluorescenčními estery (pyrénacylové deriváty), dále LC-MS/MS pro selektivní detekci reziduí a imunochemické ELISA testy založené na sendvičovém nebo kompetitivním formátu s enzymatickým značením.

Hlavní výsledky a diskuse

Microbiologické a spektrofotometrické metody poskytují rychlé orientační stanovení aktivity, avšak trpí nízkou specificitou. TLC umožňuje semikvantitativní screening s detekčními limity v řádu ppb, ale pro přesné kvantitace je nutné přejít na HPLC. HPLC s pokolónovou derivatizací vanilinem či DMABA dosahuje detekčních limitů do jednotek µg/kg v přípravcích a krmivech, avšak extrakce a čištění vzorků může být časově náročné. LC-MS/MS přináší vysokou specifičnost a citlivost (sub-ng/g) pro stanovení reziduí v živočišných tkáních a biologických matricích. ELISA poskytuje robustní screeningové testy se schopností detekovat nízké ng/g koncentrace, ale vyžaduje pečlivě kalibrované imunoreagencie.

Přínosy a praktické využití metody

Rozšířením metodik pro různé matrice se zvýšila schopnost kontrolních laboratoří sledovat správné dávkování polyéterů při výrobě premixů a krmiv a včas detekovat nepřípustná rezidua ve vykupovaných produktech. Vysoce selektivní LC-MS/MS a rychlé ELISA testy zkracují dobu analýz a umožňují včasnou reakci při porušení limitů stanovených legislativou.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj se soustředí na integraci mikroextrakce (SPE, QuEChERS) a miniaturizaci předúprav za účelem zkrácení času a snížení množství rozpouštědel. Multiplexní imunotesty a rozšířená LC-MS/MS multireziduální analýza umožní rutinní monitorování vzorků na širší škálu polyéterů a dalších veterinárních léčiv. Návrat k zelenějším metodám s využitím vodních elučních režimů a odezvou vysokorychlostní chromatografie zefektivní provoz moderních laboratoří.

Závěr

Review ukazuje, že pro screening polyéterových antibiotik se hodí rychlé mikrobiologické, spektrofotometrické a TLC metody. Pro kvantitativní stanovení krmiv a biologických vzorků jsou nejvhodnější HPLC s derivatizací a zejména LC-MS/MS díky vysoké specifičnosti a citlivosti. ELISA poskytuje výkonný nástroj pro rutinní screening. Kombinace těchto technik v diagnostických protokolech zajistí spolehlivou kontrolu veterinárních léčiv v potravinovém řetězci.

Reference

1. Berdy J., Aszalos A., Bostian M., McNitt K. L.: CRC Handbook of Antibiotic Compounds, zv. V, CRC Press, Boca Raton, Florida 1980.
2. American Board of Veterinary Toxicology: http://www.abvt.org/ionop.html
3. Akhtar H. M., Croteau L. G.: Analyst 121, 803 (1996).
4. Watanabe H., Satake A., Kido Y., Tsuji A.: Anal. Chim. Acta 437, 31 (2001).
5. Kline R. M. et al.: J. AOAC Int. 53, 49 (1970).
6. Kavanagh F. W., Willis M.: J. AOAC Int. 55, 114 (1972).
7. Vestník Ministerstva půdohospodářstva SR, částka 11, 1998.
8. Golab T. et al.: J. AOAC Int. 56, 171 (1973).
9. Martinez E. E., Shimoda W.: J. AOAC Int. 66, 1506 (1983).
10. Owles P. J.: Analyst 109, 1331 (1984).
11. Karkocha I.: Rocz. Panstw. Zakl. Hig. 34, 281 (1983).
12. Blomkvist G. B. et al.: J. Agric. Food Chem. 34, 274 (1986).
13. Dimenna G. P. et al.: J. Agric. Food Chem. 34, 805 (1986).
14. Goras J. T., Lacourse W. R.: J. AOAC Int. 67, 701 (1984).
15. Blanchflower J. W. et al.: Analyst 110, 1283 (1985).
16. Fejglova Z. et al.: J. Liq. Chromatogr. 17, 359 (1994).
17. Landgraf W. W., Ross P. F.: J. AOAC Int. 81, 844 (1998).
18. Gafner J. L.: J. AOAC Int. 82, 1 (1999).
19. VanderKop P. A., MacNeil J. D.: J. Chromatogr. 508, 386 (1990).
20. Dimenna G. P. et al.: J. AOAC Int. 70, 504 (1987).
21. Beran M., Zima J.: Chromatographia 35, 206 (1993).
22. Rodewald J. M. et al.: J. AOAC Int. 77, 821 (1994).
23. Blanchflower J. W., Rice D. R., Hamilton J. T. G.: Analyst 110, 1283 (1985).
24. Sokolic M., Pokorny M.: J. Pharm. Biomed. Anal. 9, 1047 (1991).
25. Neely F. L.: J. Liq. Chromatogr. 15, 1513 (1992).
26. Neely F. L.: Chromatographia 31, 277 (1991).
27. Bridges D. A. et al.: J. AOAC Int. 79, 1255 (1996).
28. Lapointe M. R., Cohen H.: J. AOAC Int. 71, 480 (1988).
29. Rodewald J. M. et al.: J. AOAC Int. 75, 272 (1992).
30. Coleman M. R. et al.: J. AOAC Int. 80, 693 (1997).
31. Moran J. W. et al.: J. AOAC Int. 77, 885 (1994).
32. Akhtar M. H. et al.: Food Addit. Contam. 13, 897 (1996).
33. Moran J. W. et al.: J. AOAC Int. 78, 668 (1995).
34. Gerhardt G. C. et al.: Food Addit. Contam. 12, 731 (1995).
35. Chen X. M., Shi X. X.: Sepu 17, 77 (1999).
36. Fejglova Z. et al.: J. Liq. Chromatogr. 17, 359 (1994).
37. Dimenna G. P. et al.: J. Pharm. Biomed. Anal. 11, 823 (1993).
38. Mathur A. K.: J. Chromatogr., A 664, 284 (1994).
39. Dusi G., Gamba V.: J. Chromatogr., A 835, 243 (1999).
40. Hirai T. et al.: Analyst 123, 2625 (1998).
41. Niessen W. M. A.: J. Chromatogr., A 812, 53 (1998).
42. Blanchflower J. W., Kennedy G. D.: J. Chromatogr., B 675, 225 (1996).
43. Blanchflower J. W., Kennedy G. D.: Analyst 120, 1129 (1995).
44. Volmer D. A., Lock C. M.: Rapid Commun. Mass. Spectrom. 12, 157 (1998).
45. Harris J. A. et al.: Analyst 123, 2625 (1998).
46. Hormazábal V., Yndestad M.: J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 23, 1585 (2000).
47. Crooks S. R. H. et al.: Analyst 123, 2493 (1998).
48. Muldoon M. T. et al.: J. Agric. Food Chem. 63, 1745 (1995).
49. Elissalde M. H. et al.: J. Agric. Food Chem. 41, 2167 (1993).
50. Pauillac S. et al.: J. Immunol. Methods 164, 165 (1993).
51. Mount M. E., Failla D. L.: J. AOAC Int. 70, 201 (1987).
52. Heitzman R. J. et al.: Br. Vet. J. 142, 516 (1986).
53. Stanker L. H.: Agric. Res. 44, 23 (1996).