OPTIMALIZÁCIA HPLCCOULOCHEMICKEJ METÓDY PRE STANOVENIE HOMOCYSTEÍNU A VYBRANÝCH METABOLITOV V PLAZME PO SUPLEMENTÁCII FUNKČNOU POTRAVINOU

Význam tématu

Analýza homocysteinu a jeho aminotiolových metabolitů v lidské plazmě má významný dopad na klinické i epidemiologické studie zabývající se srdečně-cévními riziky a oxidativním stresem. Monitoring hladin homocysteinu (HCY), cysteinu (CYS), redukovaného glutationu (GSH) a methioninu (MET) poskytuje cenné informace o stavu metabolických drah a nutriční expozici bioaktivním látkám, např. flavonoidům typu kvercetinu, obsaženým v potravinách.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat reverzně-fázovou HPLC metodu s coulochemickou detekcí pro simultánní stanovení HCY, CYS, GSH a MET v lidské plazmě a aplikovat ji v pilotní intervenční studii suplementace kvercetinu funkcionalizovanou potravou (cereální sušenky s cibulí) a zeleným čajem.

Použitá metodika a instrumentace

• HPLC systém: Agilent 1200 s kvartérní pumpou, termostatovanou kolónou LiChrospher 100 RP-18 (250×4,0 mm, 5 µm) a předkolónou C18 (4×4 mm, 5 µm). Detekce: ESA Coulochem II (analytická cela 5011A, ochranná cela 5020), DAD 370 nm.
• Mobilní fáze: 50 mmol/l sodný dihydrogenfosfát, 1 mmol/l oktánsulfónová kyselina, 6 % acetonitrilu, pH 2,60 (85 % H₃PO₄).
• Úprava plazmy: redukce disulfidů NaBH₄, precipitace proteinu HClO₄/EDTA, ředění mobilem.
• Intervence: 36 probandů, 2 měsíce konzumace cereálních cibulových sušenek (264 mg/kg kvercetinu) + zelený čaj, poté 2měsíční wash-out.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace organického modifikátoru ukázala, že 6 % acetonitrilu zkracuje dobu analýzy a zajišťuje adekvátní separaci všech aminotiolů. Nejvhodnější bylo pH mobilní fáze 2,60. Metoda vykázala lineární kalibrační závislosti (r>0,99) v rozsazích: CYS 12,5–300 µmol/l; GSH/HCY 1,0–40,0 µmol/l; MET 5,0–100,0 µmol/l. Intradenní i mezidenní preciznost (CV, RE) byla <10 %, LOD/LOQ pro HCY a GSH 0,3/1,3 µmol/l resp., pro CYS 5,0/16,4 µmol/l, pro MET 2,5/8,1 µmol/l. V klinickém vzorku po suplementaci kvercetinem poklesla hladina HCY z 14,2±0,8 na 11,4±0,6 µmol/l (P<0,001) a CYS a MET vykázaly podobný trend, GSH se mírně zvýšil, avšak bez statistické významnosti.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená HPLC-coulodetekční metoda umožňuje rychlou, citlivou a robustní analýzu klíčových aminotiolů v klinických a epidemiologických studiích. Je vhodná pro laboratoře zaměřené na QA/QC a biochemické biomarkery oxidativního stresu či nutriční intervence.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu analyzovaných thiolů včetně dalších disulfidů a methylovaných forem homocysteinu.
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro zlepšení selektivity a snížení mezipikových interferencí.
• Automatizace přípravy vzorků v mikrofluidních systémech.
• Uplatnění v personalizované medicíně a dlouhodobých intervenčních studiích zaměřených na prevenci kardiometabolických onemocnění.

Závěr

Byla úspěšně optimalizována a validována reverzně-fázová HPLC metoda s coulochemickou detekcí pro simultánní stanovení homocysteinu, cysteinu, redukovaného glutationu a methioninu v lidské plazmě. Metoda má dostatečnou citlivost, reprodukovatelnost a robustnost pro aplikace v klinických, epidemiologických i nutričně-intervenčních studiích.

Reference

• Melnyk S., Pogribna M., Pogribny I., Hine R.J., James S.J.: J. Nutr. Biochem. 10, 490 (2013).
• Houze P., Gamra S., Madelaine I., Bousquet B., Gourmel B.: J. Clin. Lab. Anal. 15, 144 (2001).
• Hertog M.G.L., Sweetnam P.M., Fehily A.M., Elwood P.C., Kromhout D.: Agric. Food Chem. 40, 1591 (1992).
• Cevasco G., Piątek A.M., Scapolla C., Thea S.: J. Chromatogr. A 1217, 2158 (2010).
• Huertas-Pérez J.F., Moreno-González D., AiradoRodríguez D., Lara F.J., García-Campaña A.M.: Trends Anal. Chem. 75, 35 (2015).