HPLC STANOVENIE OXIDAČNÉHO POŠKODENIA DNA V PERFUZÁTOCH PEČENE POTKANOV VPLYVOM PRÍDAVKU MEDI

Význam tématu

Reactive oxygen species a jejich vliv na poškození DNA představují klíčový indikátor oxidačního stresu v biologických systémech. Oxidovaný nukleosid 8-oxodG slouží jako spolehlivý biomarker mutagenních procesů, stárnutí a degenerativních onemocnění. Přesná kvantifikace 8-oxodG však vyžaduje standardizované a artefaktem minimalizované postupy (ESCODD iniciativy).

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a validovat HPLC metodu pro simultánní stanovení 8-oxodG a 2-deoxyguanozinu (2-dG) v DNA izolované z perfuzátů potkaní pečene a ověřit, zda přídavek CuSO4 způsobuje zvýšení oxidačního poškození DNA.

Použitá metodika a instrumentace

DNA se izolovala z izolované perfuzované pečene potkanů po přídavku 0,00; 0,01 a 0,03 mmol l–1 CuSO4. Následovala enzymatická hydrolýza P1-nukleázou a alkalickou fosfatázou. HPLC systém Agilent 1200 s kolónou Purospher® STAR C18e (150×4,6 mm, 5 µm) s mobilní fází 50 mmol l–1 fosforečnan pH 5,5 : metanol 92:8 (v/v), 0,6 ml/min, teplota 20 °C, objem injekce 50 µl. Detekce využila coulometrickou celou ESA Coulochem II (E1 +150 mV, E2 +400 mV, ochranná +100 mV) a UV detekci při 254 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární oblast 0,5–5 nmol l–1 (8-oxodG) a 60–300 µmol l–1 (2-dG) (r> 0,99). LOD činil 0,2 nmol l–1 (8-oxodG) a 12 µmol l–1 (2-dG), LOQ 0,5 nmol l–1 a 39 µmol l–1. Intradení i mezidenní přesnost (CV< 6 %) a správnost (RE< 6 %) byly splněny. Zvýšení poměru 8-oxodG/10^6 2-dG o ~50 % při 0,03 mmol l–1 CuSO4 potvrdilo souvislost toxicity medi s oxidačním poškozením DNA. Vysoké pozadí v kontrolních vzorcích poukazuje na artefakty při manipulaci s tkání a přípravě vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Citlivá a reprodukovatelná analýza oxidačního poškození DNA.
• Vhodné pro toxikologické hodnocení kovové toxicity in vitro a ex vivo.
• Standardizovaný postup pro farmaceutický výzkum a QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a miniaturizace přípravy vzorků pro snížení artefaktů.
• Přechod na LC–MS/MS detekci pro vyšší selektivitu a multiplexní analýzu.
• Standardizace metodiky v mezinárodních sítích (ESCODD).
• Neinvazivní stanovení 8-oxodG v moči jako systémový biomarker.

Závěr

Validovaná HPLC metoda s coulometrickou a UV detekcí poskytuje spolehlivé stanovení oxidačního poškození DNA v perfuzátech pečene potkanů. Zvýšení 8-oxodG koreluje s koncentrací medi, avšak baseline artefakty vyžadují další optimalizaci přípravy vzorků.

Reference

1. Roszkowski K. et al.: Medical Sci. Monitor 17, 329 (2011).
2. Valavanidis A. et al.: J. Environ. Sci. Health 27, 120 (2009).
3. ESCODD: Free Radical Res. 36, 239 (2002).
4. Riis B.: Free Radical Res. 36, 649 (2002).
5. ESCODD: Free Radical Biol. Med. 34, 1089 (2003).
6. ESCODD, Gedik C. M., Collins A.: FASEB J. 19, 82 (2005).
7. Valko M. et al.: Curr. Med. Chem. 12, 1161 (2005).
8. Jomova K., Valko M.: Toxicology 283, 65 (2011).
9. Valko M. et al.: Chem.-Biol. Interact. 160, 1 (2006).
10. Carmichael P. L. et al.: Mutat. Res. 326, 235 (1995).
11. Alexandrova A. et al.: Exp. Toxicol. Pathol. 58, 255 (2007).
12. Linder M.: Mutat. Res. 733, 83 (2012).
13. Wu L. L. et al.: Clin. Chim. Acta 339, 1 (2004).
14. Mistry V. et al.: Methods Mol. Biol. 682, 279 (2011).
15. Weimann A. et al.: Free Radical Biol. Med. 30, 757 (2001).
16. Lengger C. et al.: Anal. Biochem. 287, 65 (2000).
17. Peoples M. C., Karnes H. T.: J. Chromatogr. B 827, 5 (2005).
18. Ravanat J. L.: Free Radical Res. 46, 479 (2012).
19. Azadnia A. et al.: Anal. Biochem. 218, 444 (1994).
20. Domijan A. M., Peraica M.: Arch. Ind. Hyg. Toxicol. 59, 277 (2008).
21. Kelly M. C. et al.: J. Chromatogr. B 863, 181 (2008).
22. Loft S., Poulsen H.: J. Mol. Med. 75, 67 (1997).
23. Gedik C. M. et al.: Free Radical Res. 29, 609 (1998).
24. Lee K. F. et al.: Clin. Chim. Acta 411, 416 (2010).
25. Boysen G. et al.: J. Chromatogr. B 878, 375 (2010).
26. Hu C. W. et al.: Free Radical Biol. Med. 48, 89 (2010).
27. Singh R. et al.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 126 (2003).
28. Malayappan B. et al.: J. Chromatogr. B 1167, 54 (2007).
29. Cooke M. S. et al.: Biomarkers 14, 103 (2009).
30. Garratt L. W. et al.: Free Radical Biol. Med. 48, 1460 (2010).
31. Yoshida R. et al.: Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 11, 1076 (2002).
32. Kasai H., Nishimura S.: Nucleic Acids Res. 12, 2137 (1984).
33. Ravanat J. L. et al.: Carcinogenesis 23, 1911 (2002).
34. Kukan M.: Handbook of Drug Metabolism, Marcel Dekker (1999).
35. Jenke D.: J. Liq. Chromatogr. 19, 719 (1996a).
36. Jenke D.: J. Liq. Chromatogr. 19, 737 (1996b).
37. Currie L. A.: Pure Appl. Chem. 67, 1699 (1995).
38. Sagripant J. L., Kraemer K. H.: J. Biol. Chem. 264, 1729 (1989).
39. Drouin R. et al.: Free Radical Biol. Med. 21, 261 (1996).
40. Strubelt O. et al.: J. Toxicol. Environ. Health 47, 267 (1996).
41. Deters M. et al.: Toxicology 128, 63 (1998).
42. Schemmer P. et al.: J. Pharmacol. Exp. Ther. 290, 235 (1999).
43. Lemaster J. J., Thurman G. R.: Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37, 327 (1997).