IDENTIFIKACE PROTEINŮ KOMBINACÍ PEPTIDOVÉHO MAPOVÁNÍ A FRAGMENTACE SULFONOVANÝCH PEPTIDŮ

Význam tématu

Proteomika založená na dvourozměrné elektroforéze (2D-PAGE) a MALDI-TOF MS poskytuje rychlou identifikaci proteinů. Pro případy, kdy peptidové mapování (PMF) nevede k jednoznačné identifikaci, je klíčové doplnit analýzu o post-source decay (PSD) se chemicky asistovanou fragmentací (CAF), která usnadňuje sekvenování a lokalizaci modifikací.

Cíle a přehled studie

Studie představuje kombinovaný přístup PMF a derivatizace sulfonovaných peptidů pro PSD se selektivní produkcí y-iontů. Metoda byla demonstrována na proteinech bakterie Francisella tularensis za účelem zpřesnění identifikace a potvrzení aminokyselinových sekvencí.

Použitá metodika a instrumentace

Proteiny z 2D-PAGE byly štěpeny trypsinem, extrahovány 50% acetonitrilem s 0,5% TFA a koncentrovány ve vakuové centrifuze. Sulfoskupina byla navázána na N-terminus pomocí sukcinimidylesteru 3-sulfopropanové kyseliny a ε-aminoskupiny lysinu blokovány na homoarginin. Derivatizované peptidy byly imobilizovány na C18 ZipTip, promyty a poté analyzovány matricemi CHCA nebo DHB v pozitivním reflektronovém módu MALDI-TOF.

• Hmotnostní spektrometr: MALDI-TOF Voyager-DE STR (Applied Biosystems)
• Matice: CHCA (α-cyano-4-hydroxy-cinnamová kyselina), DHB (2,5-dihydroxybenzoová kyselina)
• Chemikálie: TFA spektrofotometrické, acetonitril LiChrosolv, voda Milli-Q
• Derivatizace: CAF-MALDI sequencing kit (Amersham Bioscience)
• Čištění a příprava: ZipTip C18 (Millipore)
• Software: ProteinProspector 3.4.1, NCBI BLAST, Data Explorer 4.0

Hlavní výsledky a diskuse

Derivatizace vedla k tvorbě výhradně y-iontů v PSD spektru, což zásadně zjednodušuje interpretaci. U několika peptidů byly potvrzeny předpokládané sekvence a modifikace lysinu. Výsledná data umožnila přesné doplnění PMF identifikace i u proteinů s nízkým počtem identifikačních peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

CAF-PSD rozšiřuje možnosti rutinní identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF MS. Umožňuje de-novo sekvenování krátkých peptidů a potvrzení posttranslačních modifikací bez potřeby pokročilých MS/MS zařízení, což je výhodné pro rychlou a účinnou analýzu v proteomických laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Důležitým směrem dalšího vývoje je vývoj nových chemických modifikátorů pro širší škálu cílových skupin peptidů, optimalizace analytických protokolů pro moderní vysokorozlišovací spektrometry a integrace s bioinformatickými nástroji pro automatizovanou interpretaci spekter. Možné je také rozšíření na kvantitativní analýzu modifikací.

Závěr

Kombinace peptidového mapování a CAF-PSD v MALDI-TOF MS významně zvyšuje spolehlivost identifikace proteinů a sekvenování peptidů, zejména u vzorků, kde standardní PMF selhává. Metoda nabízí účinný a relativně jednoduchý protokol pro pokročilé proteomické analýzy.

Reference

• Henzel W. J., Watanabe C., Stults J. T.: J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 931 (2003).
• Spengler B., Kirsch D., Kaufmann R., Jaeger E.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 6, 105 (1992).
• Šedo O., Havel J.: Chem. Listy 97, 109 (2003).
• Chaurand P., Leutzenkirchen F., Spengler B.: J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10, 91 (1999).
• Cornish T. J., Cotter R. J.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 8, 781 (1994).
• Keough T., Youngquist R. S., Lacey M. P.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7131 (1999).
• Liminga M. et al.: Proceedings of 49th ASMS Conference, Chicago 2001.
• Keough T., Lacey M. P., Youngquist R. S.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 14, 2348 (2000).
• Hellman U., Bhikhabhai R.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 16, 1851 (2002).