METODICKÉ PŘÍSTUPY SOUČASNÉ FOSFOPROTEOMOVÉ ANALÝZY

Význam tématu

Fosforylace proteinů patří k nejrozšířenějším a biologicky nejdůležitějším posttranslačním modifikacím. Reverzibilní navázání fosfátových skupin na serin, threonin či tyrosin řídí celou řadu buněčných dějů, jako je proliferace, diferenciace, přenos signálu či metabolismus. Díky genomickým a proteomickým přístupům nyní disponujeme obrovským množstvím sekvenčních dat, avšak kvantitativní a lokalizační charakterizace fosfoproteomů zůstává náročná. Fosfoproteomika tak spojuje separační techniky, afinitní obohacování, chemickou derivatizaci a hmotnostní spektrometrii za účelem komplexního zkoumání fosforylace na úrovni celých systémů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem přehledové studie je představit stav současných metod fosfoproteomové analýzy, včetně nejčastěji používaných přístupů k selektivnímu záchytu fosfoproteinů a fosfopeptidů, technik pro identifikaci a lokalizaci míst fosforylace a způsobů relativní i absolutní kvantifikace. Studie popisuje možnosti i limity jednotlivých přístupů a ukazuje, že neexistuje jediná univerzální metoda, ale je třeba optimálně kombinovat různé principy podle typu vzorku a hledaných informací.

Použitá metodika a instrumentace

V přehledu jsou diskutovány následující metodické strategie:

• Imunoprecipitace s protilátkami proti pY (fosfotyrosinu).
• Afinitní chromatografie s imobilizovanými ionty kovů (IMAC) a adsorpce na TiO2 (Titansphere).
• Chemická modifikace fosfátové skupiny pomocí β-eliminace a následné thiolové adice pro selektivní značení pS/pT.
• MALDI-TOF a ESI-LC-MS/MS s využitím speciálních matric, aditiv a režimů záporných iontů pro zvýšení citlivosti vůči fosfopeptidům.
• Detekční módy tandemové MS: neutral loss scanning, precursor ion scan, iminiový ion pro pY, ECD (Electron Capture Dissociation) v FT-ICR, CID (Collisionally Induced Dissociation).
• Izotopicky značené kvantifikace: in vivo 15N-značení, SILAC, in vitro izotopicky kódované afinitní značky (PhIAT, ICAT), absolutní kvantifikace AQUA, metody založené na normalizovaném iontovém proudu.
• Další speciální techniky: ICP-MS pro měření 31P/32S, iontová mobilita pro konformační studium fosfopeptidů.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza ukazuje, že každá metoda má své přednosti i slabiny. Imunoprecipitace pY proteinů je vysoce specifická, avšak pro pS/pT stále omezeně použitelná. IMAC a TiO2 poskytují účinný záchyt fosfopeptidů, ale trpí nespecifickou vazbou karboxylovaných peptidů, což lze zlepšit esterifikací nebo použitím grafitových mikrokolonek. Chemická derivatizace odstraňuje labilní fosfát a nahradí ho stabilní skupinou, což zvyšuje kvalitu MS/MS spekter a umožňuje spolehlivou lokalizaci modifikace. Tandemová MS s režimem neutral loss a precursor ion scan usnadňuje screening fosfopeptidů, zatímco ECD-FT-ICR nabízí nejkomplexnější fragmentaci bez ztráty fosfátu. Kvantitativní analýzy ukazují, že relativní značení (SILAC, PhIAT) poskytují robustní srovnání stavů, zatímco absolutní metody AQUA a normalizovaný iontový proud umožňují stanovit skutečnou stechiometrii fosforylace.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost globálního mapování fosforylace v buňkách a organelách.
• Studium dynamických změn signálních kaskád v čase či za různých podmínek.
• Objev biomarkerů při onemocněních a hodnocení cílené léčby (kinasové inhibitory).
• Vedoucí k hlubší funkční charakterizaci proteinů a jejich interakcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Hlavními směry dalšího vývoje jsou: online propojení afinitních kroků (IMAC/TiO2) s LC-MS čipovou technologii, zdokonalování fosfospecifických protilátek pro pS/pT, integrace ECD-FT-ICR do rutinních analýz, rozšíření absolutní kvantifikace a systémová fosfoproteomika na úrovni tkání a celých organismů. Automatičtější, vysoce propustné workflow přiblíží fosfoproteomiku klinickým aplikacím.

Závěr

Fosfoproteomová analýza zůstává metodicky náročná kvůli nízkému zastoupení modifikovaných forem, dynamice fosforylace a chemické labilitě. Žádná jednotlivá technika nepokrývá všechny potřeby, proto je klíčové strategicky kombinovat afinitní obohacení, chemickou derivatizaci a pokročilé režimy MS/MS. Neustálý rozvoj instrumentace a kvantifikačních protokolů umožní v budoucnu rutinní mapování a přesné měření fosforylace v biomedicínském výzkumu i průmyslové analytice.

Reference

• 1. Mann M., Ong S. E., Gronborg M., Steen H., Jensen O. N., Pandey A.: Trends Biotechnol. 20, 261 (2002).
• 2. Pinkse M. W., Uitto P. M., Hilhorst M. J., Ooms B., Heck A. J.: Anal. Chem. 76, 3935 (2004).
• 3. Oda Y., Nagasu T., Chait B. T.: Nat. Biotechnol. 19, 379 (2001).
• 4. Steen H., Kuster B., Fernandez M., Pandey A., Mann M.: Anal. Chem. 73, 1440 (2001).
• 5. Zhao H., Liu M., Riehn R., Arora R., SIlverstein K. A., Wang L., Emmett M. R., Marshall A. G., Grant E. R.: Anal. Chem. 76, 5861 (2004).
• 6. Gerber S. A., Rush J., Stemman O., Kirschner M. W., Gygi S. P.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 6940 (2003).
• 7. Rusnak F., Zhou J., Hathaway G. M.: J. Biomol. Tech. 13, 228 (2002).
• 8. Qian W. J., Goshe M. B., Camp D. G., 2nd, Yu L. R., Tang K., Smith R. D.: Anal. Chem. 75, 5441 (2003).
• 9. Bennett K. L., Stensballe A., Podtelejnikov A. V., Moniatte M., Gronborg M., Jensen O. N.: J. Mass Spectrom. 37, 179 (2002).
• 10. Steen H., Jebanathirajah J. A., Springer M., Kirschner M. W.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3948 (2005).