ANALÝZA PEPTIDŮ POMOCÍ HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE MALDI-TOF

Význam tématu

Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry MALDI TOF MS je klíčová pro analýzu peptidů díky schopnosti detekovat vysokomolekulární biomolekuly a identifikovat jejich strukturu fragmentací. Metoda usnadňuje šetrnou ionizaci peptidů a proteinů a poskytuje rychlé informace o molekulové hmotnosti a aminokyselinové sekvenci. To je nezbytné pro studium neuroprotektivních peptidů a výzkum proteomu v rámci komplexních biologických vzorků.

Cíle a přehled studie

Autorům šlo o ověření metodiky stanovení molekulové hmotnosti a struktury peptidů pomocí PSD po MALDI TOF analýze. Studie demonstruje analýzu známých hormonů, neurčitých peptidů a synteticky připravených derivátů neuroprotektivního peptidu humaninu. Klíčovou rolí je využití iontové brány pro selektivní fragmentaci iontů a následné určení aminokyselinové sekvence.

Použitá instrumentace

MALDI TOF Axima CFR Shimadzu Kratos Analytical pracující v reflektronovém pozitivním módu
Matriční činidlo α cyano 4 hydroxyskokořicová kyselina CHC
Redestilovaná voda z aparatury Heraeus, acetonitril a kyselina trifluoroctová Merck

Metodika

Vzorky peptidů byly naneseny v poměru 1:1 s matricí CHC v roztoku 0,1 % TFA a acetonitrilu. Po zaschnutí byla analýza provedena pulsy laseru s různým výkonem a se zpožděnou extrakcí. Pro selekci fragmentů typu PSD byla použita iontová brána nastavená na požadované m/z rozpětí. Fragmentační ionty typu a b a y sloužily k odvození částí sekvence.

Hlavní výsledky a diskuse

PSD spektra hormonů luteinizačního a vylučovacího hormonu potvrdila charakteristické piky a b i y. Analýzou neznámého peptidu byla z m/z rozdílů identifikována část sekvence a databázové vyhledání odhalilo odpovídající bombesin. Syntéza humaninového derivátu se komplexem OsO4 bipyridinu ukázala hlavní produkt s molekulovou hmotností v souladu s teoretickým modelem a fragmenty odvozené PSD potvrdily strukturu derivátu.

Přínosy a praktické využití metody

MALDI TOF MS umožňuje rychlé a přesné stanovení molekulové hmotnosti peptidů ve složitých směsích bez nutnosti chromatografické separace. PSD poskytuje dodatečnou informaci o sekvenci, což je užitečné pro identifikaci posttranslačních modifikací i ověření čistoty syntetických peptidů. Metoda je vhodná pro kontrolu kvality v průmyslové syntéze a výzkumná studia biologických vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se zaměřuje na vylepšení rozlišení a citlivosti TOF analyzátorů, implementaci iontové mobilitní spektrometrie a rozšíření databází fragmentačních vzorů. Aplikace zahrnují studium komplexních proteomických profilů, vyhledávání biomarkerů a design derivatizačních činidel pro selektivní označování aminokyselinových zbytků.

Závěr

Metodika MALDI TOF MS doplněná PSD fragmentací prokázala vysokou spolehlivost v určení molekulové hmotnosti a struktury peptidů. Umožnila identifikaci známých i neznámých peptidů a ověření syntézních derivátů neuroprotektivního peptidu humaninu. Metoda se ukazuje jako cenný nástroj pro analýzu peptidů v biochemických a farmaceutických aplikacích.

Reference

• Marvin L F, Zatylny C, Leprince J, Vandry H, Henry J Peptides 9 1391 2001
• Ovsyannikova G, Johnson K L, Naylor S, Poland G A J Immunol Methods 246 1 2000
• Flad T, Kalbacher H, Kaufmann R, Spangler B, Meyer H Immunol Lett 56 336 1997
• Sarver A, Scheffler N K, Shetler M D, Gibson B W J Am Soc Mass Spectrom 12 439 2001
• Talbo G H, Suckau D, Malkoski M, Reynolds E C Peptides 22 1093 2001
• Reiber D, Grover T A, Brown R S Anal Chem 70 673 1998
• Hashimoto Y, Niikura T, Tajima H, Yasukawa T, Sudo H, Ito Y, Kita Y, Kawasumi M, Kouyama K, Doyu M, Sobue G, Koide T, Tsuji S, Lang J, Kurokawa K, Nishimoto I Proc Natl Acad Sci U S A 98 6336 2001
• Patočka J, Slaninová J Cesk Slov Psychiat 98 221 2002
• ProteinProspector MS Seq update OWL database 7.2.2001
• Deetz J S, Behrman E J J Org Chem 45 135 1980
• Emerman M, Behrman E J J Histochem Cytochem 30 395 1981