CHARAKTERIZACE PROTEOMU BAKTERIOFÁGA 812

Význam tématu

Studium proteomu bakteriofága 812 představuje klíčový krok k pochopení molekulárních mechanismů jeho infekčního cyklu a hostitelského rozsahu. Detailní přehled strukturních proteinů usnadňuje vývoj fágové terapie, která je slibnou alternativou k antibiotikům proti rezistentním bakteriím.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo charakterizovat kompletní proteom standardního typu bakteriofága 812 metodami hmotnostní spektrometrie a gelové elektroforézy. Studie navazuje na existující znalosti genomu a proteomu příbuzného fága K a usiluje o rozšíření seznamu identifikovaných proteinů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci proteinu byla využita jednorozměrná SDS-PAGE na přístroji Protean II (Bio-Rad) s barvením Coomassie a stříbrným barvivem. Proteiny byly enzymaticky štěpeny trypsinem a analyzovány následujícími technikami:

• MALDI MS na přístroji Reflex IV (Bruker) s matricí HCCA
• MALDI TOF/TOF MS na 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems)
• HPLC-ESI MS/MS s iontovou pastí Esquire 2000 (Bruker) kombinovanou s kapilární chromatografií LC Packings

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo identifikováno 11 proteinů fágového virionu, včetně dvou majoritních strukturálních komponent – hlavního kapsidového proteinu a hlavního proteinu bičíkové pochvy (812_mtsp). Sedm proteinů bylo zařazeno mezi strukturní na základě homologie s proteinovými databázemi příbuzných fágů, dva dosud funkčně neznámé. Neobvyklá dvojitá migrace proteinu 812_mtsp (molekulová hmotnost dvojnásobná vůči očekávané) byla objasněna modifikací SDS-PAGE podmínek, kdy byla jediná zóna rozdělena do tří fragmentů odpovídajících C- a N-koncovým oblastem proteinu. Tato fragmentace potvrzuje možné post-translační štěpení nebo strukturální restrukturalizaci.

Přínosy a praktické využití metody

Kombinace SDS-PAGE a MALDI TOF/TOF MS se ukázala jako spolehlivá cesta k rychlé identifikaci majoritních fágových proteinů. Metoda nabízí dostatečnou citlivost a rozlišení pro rozbor jednoduchých proteomů a je snadno dostupná v běžné laboratorní praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další výzvou je aplikace dvourozměrné elektroforézy pro rozšíření seznamu identifikovaných minoritních proteinů, jako jsou lytické enzymy. Porovnání proteomů mutantů a příbuzných fágů (U16, SK311, 131, Twort) umožní korelaci změn proteomu s hostitelským rozsahem. Integrace kvantitativních metod hmotnostní spektrometrie povede k detailnímu mapování expresních vzorců během infekčního cyklu.

Závěr

Proteomická analýza bakteriofága 812 přinesla identifikaci 11 proteinů včetně klíčových strukturních komponent a odhalila neobvyklé štěpení hlavního bičíkového proteinu. Výsledky vytvářejí pevný základ pro další porovnávací studie a podporují rozvoj fágové terapie.

Reference

• Rosypal S. et al. Virology 246, 241 (1998)
• O’Flaherty S. et al. J. Bacteriol. 186, 2862 (2004)
• Doškař J. et al. 11th International Symposium on Staphylococci & Staphylococcal Infections, Charleston 2004
• Pantůček R. et al. Scripta Fac. Sci. Nat. Univ. Purk. Brun. 2, 105 (1972)
• Havliš J. et al. Anal. Chem. 75, 1300 (2003)