HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE VE STRUKTURNÍ BIOLOGII: URČOVÁNÍ VYŠŠÍ STRUKTURY PROTEINŮ A PROTEINOVÝCH KOMPLEXŮ

Význam tématu

Biologické procesy jsou řízeny prostorovou a dynamickou strukturou proteinů a jejich komplexů. Klasické metody jako rentgenová krystalografie nebo NMR poskytují vysoké rozlišení, avšak narážejí na omezení plynoucí z flexibility proteinů nebo nutnosti krystalizace. Hmotnostní spektrometrie (MS) se díky měkké ionizaci stala citlivým nástrojem pro charakterizaci proteinů v nativních podmínkách i pro mapování vyšších struktur.

Cíle a přehled článku

Článek shrnuje čtyři hlavní přístupy MS používané ve strukturní biologii: chemické zesítění (CX-MS), výměnu vodíku za deuterium (HDX-MS), nativní MS a afinitní MS (AP-MS). Popisuje jejich zásady, výhody a úskalí, instrumentální požadavky a možnosti kombinací pro odhalení konformací, složení a dynamiky proteinů a komplexů.

Použitá metodika a instrumentace

• Chemické zesítění: použití bifunkčních činidel (např. DSS, BS3, EDC) k navázání reaktivních skupin Lys, Cys či karboxylových zbytků a mapování prostorových vazeb.
• HDX-MS: sledování kinetiky výměny amidových protonů za deuteriové v různých časových pulzech, okamžitá quench-reakce nízkým pH a teplotou, následná LC-MS/MS analýza.
• Nativní MS: udržení proteinů či komplexů v těkavém pufru (amonný octan), měkká ionizace ESI a analyzátory s širokým rozsahem m/z (Q-TOF, FT-ICR) i iontově mobilitní techniky (TWIMS, DMA).
• AP-MS: izolace proteinu „nástrahy“ s vazebnými partnery pomocí specifických protilátek nebo afinitních značek (flag, biotin), identifikace pomocí proteomiky „zdola“.

• Hlavní instrumentace zahrnuje LC-MS systémy s vysokým rozlišením, TOF a FT-ICR hmotnostní analyzátory, kolizně indukovanou disociaci (CID), aktivační metody ECD/ETD i iontovou mobilitu.

Hlavní výsledky a diskuse

MS metody poskytují vzájemně doplňující se informace:

• CX-MS stanovuje přibližné vzdálenosti (7–30 Å) mezi zbytky a omezuje modelovací prostor pro složité komplexy.
• HDX-MS odhaluje dynamiku a stabilitu domén i jejich interakcí s ligandy, a to s peptidovým až aminokyselinovým rozlišením.
• Nativní MS dokládá složení a stechiometrii velkých sestav (např. 20S proteasom 2,5 MDa) a sleduje jejich disociaci či změny podmínek.
• AP-MS mapuje vazebné partnery in vivo či ex vivo, včetně kvantitativních změn, přičemž řeší nespecifické kontaminanty.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplementarita k NMR, rentgenové a elektronové mikroskopii umožňuje integrativní modelování proteinových struktur.
• Studium velkých, flexibilních i heterogenních komplexů v nativních podmínkách bez nutnosti krystalizace či vysokých koncentrací.
• Mapování protein–protein a protein–ligand interakcí, vývoj a validace farmakologických inhibitorů, charakterizace skládání proteinů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj nových cross-linkerů s lepší specifitou, rozpustností a izotopovou značkou pro vyšší citlivost a selektivitu.
• Zlepšení softwaru pro automatickou identifikaci zesítěných peptidů a snížení falešných pozitiv.
• Pokročilá chromatografie, iontová mobilita a kombinace s Cryo-EM pro detailnější konformační mapy.
• In vivo cross-linking a HDX-MS přímo ve živém buňce či tkáni pro studium dynamiky v reálném prostředí.

Závěr

Hmotnostní spektrometrie představuje přelomový soubor metod pro analýzu struktury a dynamiky proteinů a jejich komplexů. Díky kombinaci chemických modifikací, nativního zachycení a afinitních izolací lze získat komplementární data, která spolu s klasickými technikami a modelováním otevírají nové možnosti strukturní biologie.

Reference

Vybrané přehledné a metodické studie: Sinz A.: Mass Spectrom. Rev. 25, 663 (2006); Konermann L. et al.: Curr. Opin. Struct. Biol. 21, 634 (2011); Heck A. J.: Nat. Methods 5, 927 (2008); Hyung S. J., Ruotolo B. T.: Proteomics 12, 1547 (2012); Zhang Z., Smith D. L.: Protein Sci. 2, 522 (1993) a další originální práce citované v původním textu.