Short gradients with Bruker’s nanoElute coupled to the timsTOF Pro with PASEF — Throughput and deep proteome measurements

Význam tématu

Vysokopropustná a zároveň hluboká analýza proteomů je klíčová pro objevy v klinickém výzkumu a biomarkerovou validaci. Krátké chromatografické gradienty kombinované s vysokou sekvenační rychlostí přístrojů Bruker nanoElute a timsTOF Pro s PASEF umožňují zrychlit měření až na 50 vzorků za den, aniž by došlo k zásadnímu poklesu v hloubce identifikace proteinů a peptidů.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na:

• Optimalizaci podmínek oddělení během nano-LC se zkrácenými gradienty.
• Integraci přístrojů nanoElute a timsTOF Pro s PASEF pro maximální zátěž denní série vzorků.
• Testování reprodukovatelnosti identifikací a kvantifikace na 250 ng HeLa digestu.
• Demonstraci hluboké proteomové analýzy za použití off-line frakcionace.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický tok zahrnoval:

• Nano-LC systém nanoElute se zkráceným cyklem: injekce až do injekce 28,8 min, tok 500 nl/min, provozní tlak do 500 bar.
• Kolony: fritovaná kapilára 100 mm × 75 μm s ReproSil C18 1,9 μm (120 Å).
• MS detekci: timsTOF Pro s trapped ion mobility (TIMS) a PASEF (Parallel Accumulation–Serial Fragmentation).
• Off-line frakcionace: vysoké pH reverzní fáze do 24 concatenated frakcí pro hlubokou analýzu za 12 h MS běhu.

Hlavní výsledky a diskuse

V krátkém běhu 21,4min gradientu při 28,8min celkovém cyklu bylo dosaženo v průměru 4180 skupin proteinů a 26 000 unikátních peptidů s vysoko rychlým PASEF skenováním (>120 Hz). Reprodukovatelnost byla pro proteiny i peptidy nad 90 % pokrytí v 30 po sobě jdoucích bězích, CV hodnoty pro relativní kvantifikaci se pohybovaly kolem 10 % a Pearsonova korelace mezi replikáty >0,97. Off-line frakcionace umožnila v 12h analýze identifikovat >9000 proteinových skupin z HeLa a >10 000 z myší cerebella a vytvořit knihovnu 100 000 CCS hodnot peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný nano-LC tok s krátkými gradienty a vysokou rychlostí PASEF umožňuje:

• Zvýšit denní propustnost až na 50 vzorků bez výrazné ztráty analytické hloubky.
• Rychle generovat rozsáhlé knihovny peptidových CCS pro DDA i DIA workflow.
• Dosáhnout robustnějšího provozu při nižším zpětném tlaku a delší životnosti kolony.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj by mohl směřovat k:

• Integraci ještě rychlejších mobilitních separací a paralelního zpracování dat v reálném čase.
• Automatizované off-line a on-line frakcionace pro komplexní vzorky v klinických studiích.
• Algoritmickému zpracování velkých knihoven CCS pro přesnější kvantitativní workflow v DIA přístupech.

Závěr

Krátké LC gradienty ve spojení s nanoElute a timsTOF Pro s PASEF poskytují vynikající kompromis mezi propustností a hloubkou proteomové analýzy. Redukce režijních časů a využití TIMS separace dovolují rychlou a robustní identifikaci a kvantifikaci tisíců proteinů i ve vysokopropustných aplikacích.

Reference

1. Meier F. a kol. Parallel accumulation–serial fragmentation (PASEF): Multiplying sequencing speed and sensitivity by synchronized scans in a trapped ion mobility device. J. Proteome Res. 2015; DOI: 10.1021/acs.jproteome.5b00932.
2. Meier F. a kol. Online parallel accumulation–serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol. Cell. Proteomics. 2018; DOI: 10.1074/mcp.TIR118.000900.