timsTOF Pro with PASEF and Evosep One: Maximizing throughput, robustness and analytical depth for shotgun proteomics

Význam tématu

Vysokopropustná a hloubková shotgun proteomika je klíčová pro analýzu rozsáhlých biologických a klinických vzorků. Tradiční nano-LC-MS/MS systémy s dlouhými gradiencemi dosahují sice dobré hloubky, ale trpí nízkou propustností, omezenou robustností a vyššími objemy vzorku. Kombinace nových chromatografických postupů s rychlými hmotnostními spektrometry přináší možnost analyzovat stovky vzorků denně s minimálními dávkami vzorku a vysokou reprodukovatelností.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované aplikace je demonstrovat výkon spojeného systému Evosep One a timsTOF Pro s akviziční metodou PASEF a separací TIMS. Hlavními úkoly jsou:

• Maximalizace počtu identifikovaných proteinů při minimální délce gradientu.
• Zajištění vysoké robustnosti a reprodukovatelnosti měření.
• Ukázat vhodnost přístrojové sestavy pro biomarkerové studie a klinickou proteomiku.

Použitá metodika a instrumentace

Systém Evosep One využívá preformované gradienty uložené v oddělovací smyčce, které jsou pomocí čtyř nízkotlakých pump postupně modifikovány a přepouštěny přes krátké analytické kolony (4 a 8 cm). Tento přístup zajišťuje nízký mrtvý čas (2–3 min) mezi vzorky a minimální kontaminaci.
Hmotnostní spektrometr timsTOF Pro kombinuje tridimenzionální separaci TIMS (retence, iontová mobilita, m/z) s metodou PASEF (Parallel Accumulation Serial Fragmentation). Rychlé přepínání kvadrupólu umožňuje fragmentovat 100–350 prekurzorů/s při dobrém poměru signál/šum.

Hlavní výsledky a diskuse

Při použití gradientů délky 5,6, 11,5 a 21 minut byly z 50 ng digestu HeLa identifikovány průměrně 1 400, 2 300 a 2 800 proteinových skupin. Měřeno v 15 technických replikách:

• 5,6 min gradient: 200 vzorků/den, ~1 400 proteinových skupin.
• 11,5 min gradient: 100 vzorků/den, ~2 300 proteinových skupin.
• 21 min gradient: 60 vzorků/den, ~2 800 proteinových skupin.

Reprodukovatelnost byla vysoká: R² ~ 0,97 napříč 96 běhy, CV Total Ion Chromatogram intenzit 2,3 % a kvantifikace v dynamickém rozsahu tří řádů.

Přínosy a praktické využití metody

Evosep One v kombinaci s timsTOF Pro umožňuje:

• Rychlou analýzu stovek vzorků denně bez značného kompromisu na hloubce pokrytí.
• Minimální spotřebu vzorku (50 ng) a snížené riziko kontaminace.
• Vysokou robustnost díky orthogonálnímu ESI rozhraní a krátkým kolónám.
• Reprodukovatelné kvantitativní výsledky vhodné pro biomarkerové studie a QA/QC procesy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj směřuje k automatizaci a integraci s dalším omickým vyšetřením, využití strojového učení pro vyhledávání vzorců ve velkých datech a rozšíření aplikací na analýzu vzácných či omezených vzorků (biopsie, single-cell proteomika). Zvýšení rychlosti a hloubky bude podporovat masivní klinická kohortní šetření.

Závěr

Kombinace Evosep One a timsTOF Pro s akvizicí PASEF tvoří vysoce výkonný a robustní workflow pro shotgun proteomiku. Umožňuje dosažení vysoké propustnosti (až 200 vzorků/den), citlivosti a reprodukovatelnosti při minimálních požadavcích na vzorek, což otevírá nové možnosti pro rozsáhlé studie a klinické aplikace proteomiky.