Single-shot quantitative plasma proteomics using the PASEF method

Význam tématu

Proteomika lidské plazmy představuje klíčový zdroj biochemických markerů pro klinické i biologické studie díky snadné dostupnosti vzorků a bohatému repertoáru proteinů. Vysoká dynamika koncentrace proteinů v plazmě však komplikuje hloubkovou analýzu a nutí k optimalizaci rychlých a citlivých metod bez ztráty kvantitativní relevance.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentovaného výzkumu bylo ověřit schopnost jednoduché single-shot analýzy nevyčištěné plasmy kombinované s metodou PASEF (Parallel Accumulation–Serial Fragmentation) dosáhnout hlubokého pokrytí proteomu při vysoké průchodnosti vzorků. Autoři porovnali různé délky chromatografických gradientů a ověřili vliv zařazení knihoven z depletovaných vzorků na rozsah kvantifikovaných proteinů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byla použita komerční preprava iST (PreOmics) po trypsinové digesci. Pro případnou depleci nejabundantnějších proteinů plazmy se využily chromatografické kolony Agilent Human-6 a Sigma IgY14. Analytická část zahrnovala:

• nanoElute HPLC systém s kolonkou Aurora (25 cm) pro 30–45minutové gradienty
• Bruker TEN kolona pro 20minutové gradienty
• timsTOF Pro s PASEF akvizicí pro efektivní využití iontů a rychlé MS/MS analýzy
• Software MaxQuant pro DDA data processing a Spectronaut pro dia-PASEF kvantifikaci

Hlavní výsledky a diskuse

Analýzy ukázaly, že:

• V 45minutovém gradientu bylo v průměru kvantifikováno 345 proteinových skupin v single-shot DDA PASEF bez použití knihovny.
• Při použití 30minutového gradientu a matching k depletované knihovně vzrostl počet identifikovaných proteinů nad 550.
• I při velmi přísných matchovacích oknech (retence 6 s, mobilita 0,01) zůstalo zachováno kvantifikováno více než 460 proteinů.
• DIA-PASEF analýzy v 25minutových bězích dosáhly kvantifikace přes 410 proteinů z neodstraněné plazmy.
• Data completeness přes 90 % byla dosažena pro většinu proteinů a dávková variabilita (LFQ CV) zůstala v přijatelné oblasti i pro nízkomolekulární proteiny.

Přínosy a praktické využití metody

Simplicity single-shot workflow bez nutnosti složité deplece nebo frakcionace výrazně zvyšuje propustnost a snižuje náklady na analýzu velkých kohort. Vysoká rychlost a dostatečná hloubka pokrytí otevírá cestu pro rutinní biomarkerové studie, screening pacientských vzorků a QA/QC v průmyslovém prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Mezi klíčové směry dalšího rozvoje patří:

• Zkoumání prodloužených gradientů v DIA režimu pro kvantifikaci až 1000 proteinů v nevyčištěné plazmě
• Rozšíření knihoven o vzorky z různých populací a nemocí pro zlepšení pokrytí a přenositelnosti výsledků
• Nasazení vysoce automatizovaných přípravných linek pro další zvýšení throughputu
• Integrace s pokročilými bioinformatickými nástroji pro rychlou detekci potenciálních biomarkerů

Závěr

Single-shot kvantitativní proteomika plazmy pomocí PASEF na platformě timsTOF Pro poskytuje vyvážený poměr mezi rychlostí, hloubkou pokrytí a kvantitativní spolehlivostí. Využití matchingu k depletované knihovně výrazně posiluje detekční výkon a usnadňuje přechod do rutinní laboratoře. Metoda tak slibuje široké uplatnění ve výzkumu i diagnostice.

Reference

1. Kaspar-Schönenfeld S. a kol. Single-shot quantitative plasma proteomics using the PASEF method. ASMS 2020, ThP 493.