Parallel accumulation – serial fragmentation combined with data-independent acquisition (diaPASEF)

Význam tématu

Prohloubená analýza složitých proteomických vzorků vyžaduje metody s vysokou citlivostí, reprodukovatelností a škálovatelností. Data-independent acquisition (DIA) eliminuje náhodný výběr prekurzorů typický pro DDA a zajišťuje konzistentní kvantifikaci napříč rozsáhlými soubory vzorků. Kombinace DIA s paralelním akumulováním a sekvenováním iontů v TIMS (PASEF) na přístroji timsTOF Pro (diaPASEF) otevírá možnosti pro hluboké proteomické pokrytí s téměř 100% využitím iontového proudu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat výkon diaPASEF při jednorázové analýze komplexního lidského celulárního proteomu (HeLa) a optimalizovat nastavení DIA oken v m/z-CCS rovině pro maximální počet identifikovaných a kvantifikovaných proteinů. Studie porovnala čtyři schémata umístění izolačních oken za účelem balancování specificity a cyklického času.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: HeLa buněčný lyzát, proteinová koncentrace 200 ng na injekci, digesce LysC/trypsinem.

Chromatografie a hmotová spektrometrie:

• Nanoflow LC se 50 cm C18 kolonkou, lineární gradient 5–30 % organiky za 95 min.
• TIMS-QTOF hmotový analyzátor timsTOF Pro (Bruker Daltonics) s režimem diaPASEF.
• 100 ms TIMS sken, 1 MS + 10 PASEF MS/MS skenů na cyklus (~1,1 s), datový tok ~109 Hz.

Měření a nastavení izolace:

• Čtyři schémata diaPASEF oken (všechny 25 Th, 4 kroky na scan, ~2 s cyklus).
• Schémata 3 a 4 pokrývají dvě diagonální linie v m/z-CCS rovině pro vyšší matici iontů.

Data-processing:

• Spectral library z 48 frakcí DDA PASEF (MaxQuant).
• Ion Mobility DIA Analysis Kit (Mobi-DIK) na bázi OpenMS pro kalibraci a extrakci signálů (masy, ret. čas, CCS).
• FDR kontrolován na 1 % pro peptidy i proteiny (PyProphet).

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizované schéma 3 vykázalo nejlepší parametry:

• 61 503 peptidových peacků oproti ~42–59 000 u ostatních schémat.
• 7 371 proteomických skupin při 1% FDR (průměr triplikátů).
• Reprodukce kvantifikace: medián CV 10 %, průměrný Pearson R > 0,96 mezi replikáty.

Schémata 3 a 4 se výrazně podílela na lepším zachycení dvou- i trojnásobně nabitých peptidů díky širšímu pokrytí CCS rozsahu. Metoda diaPASEF prakticky využívá téměř celý iontový proud generovaný elektrosprejem, což zvyšuje počet detekovaných signálů bez ztráty specifity.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a hloubková jednorázová analýza proteomu s nízkou spotřebou vzorku (200 ng).
• Vysoká reprodukovatelnost a minimální chybovost kvantifikace napříč sérií runů.
• Využití pevné korelace m/z a CCS pro přesnější cílenou extrakci datové matice.
• Metoda vhodná pro aplikace QA/QC, studie PTM modulací, biomedicínský výzkum či farmaceutickou validaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření library-free nebo hybridních přístupů pro ještě větší hloubku proteomiky bez předchozí frakcionace.
• Automatizace a real-time decision making ve výběru DIA oken dle okamžitých dat z TIMS.
• Integrace s multi-omics přístupy a zpracování v cloudových či HPC prostředích pro vysokopropustné studie.
• Potenciál pro aplikace v klinické proteomice díky rychlému zpracování a vysoké robustnosti dat.

Závěr

diaPASEF na přístroji timsTOF Pro kombinuje výhody vysoké duty cycle PASEF a konzistence DIA pro hlubokou a reproducibilní analýzu komplexních proteomických vzorků. Optimalizované schéma izolace (schéma 3) umožňuje jednorázově identifikovat a kvantifikovat přes 7 000 proteinů z 200 ng digestu při vynikající kvantitativní přesnosti, čímž se tato technologie řadí mezi přední metody pro moderní proteomiku.

Reference

1. Meier F. et al. J Proteome Res (2015), doi:10.1021/acs.jproteome.5b00932
2. Meier F. et al. Mol Cell Proteomics (2018), doi:10.1074/mcp.TIR118.000900
3. Aebersold R. & Mann M. Nature (2016), doi:10.1038/nature19949
4. Gillet LC et al. Annu Rev Anal Chem (2016), doi:10.1146/annurev-anchem-071015-041535
5. Röst P. et al. Nat Methods (2016), doi:10.1038/nmeth.3959
6. Deutsch EW et al. Mol Cell Proteomics (2012), doi:10.1074/mcp.R111.015040