Characterization of Glycosylation in the Fc Region of Therapeutic Recombinant Monoclonal Antibody

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují jednu z nejdynamičtějších skupin bioterapeutik. Detailní profilování glykozylace je zásadní pro zajištění jejich kvality, účinnosti a stability. Rychlé a přesné metody LC–TOF MS významně zkracují čas analýzy a podporují vývoj i kontrolu kvality v biotechnologickém průmyslu.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout rychlou a efektivní metodiku pro detailní charakterizaci glykozylace lidské IgG1 protilátky exprimované v CHO buňkách. Analýza probíhala ve dvou krocích: nejprve byl charakterizován intaktní IgG1, poté byl protilátka štěpena papainem pro izolaci Fc fragmentu a následnou lokalizovanou analýzu glykozylace. Komplementárně byla použita mAb-glyco chip LC/MS k ověření a sestavení databáze přesných hmotnostních hodnot glykánů.

Použitá instrumentace

• Agilent 1200 Infinity Series LC s auto-injektorem, binárním pumpou, termostatovanou kolonkou (TCC) a DAD detektorem (225 nm, 280 nm) spojené s Agilent 6224 TOF LC/MS.
• Agilent Poroshell 300 SB-C3 kolona (2.1×75 mm, 5 µm) pro RP separace intaktního IgG1 a Fc fragmentu.
• Agilent 1200 Infinity HPLC-Chip/MS (mAb-glyco Chip Kit) se 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS pro rychlou glykanovou analýzu.

Použitá metodika

• Reverzní fázová LC separace na superficially porous C3 koloně při 80 °C s gradientem směsi vody, kyseliny octové, kyseliny mravenčí, TFA a organických rozpouštědel (IPA/ACN/voda).
• TOF MS snímání v pozitivním iontovém modu s rozsahem m/z 100–7000; data zpracována metodou maximální entropie pro identifikaci glykoform.
• Papainová digestie pro oddělení Fc a Fab fragmentu; čištění spin kolonkami a LC/MS analýza fragmentů.
• Online odběr uvolněných glykánů pomocí mAb-glyco chipu, enzymatická exkstrakce PNGase F a PGC kolona pro nanolitrovou LC/MS analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Intaktní IgG1 bylo rychle separováno na superficially porous C3 koloně za méně než 2 minuty; dekonvoluce masových spekter odhalila tři hlavní glykoformy s rozdílem hmotnosti ~162 Da, indikující střídání hexosových jednotek.
• Papainová digestie selektivně oddělila Fc fragment, jehož LC/MS analýza ukázala řadu glykoform o rozestupu 162 Da; jejich relativní abundance byla kvantifikována pro profilování heterogenity.
• Komplementární glyco chip analýza potvrdila identifikované glykany a umožnila sestavení přesné hmotnostní databáze pro validaci TOF výsledků.

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení doby analýzy glykozylace na jednotky minut usnadňuje vysokopropustné screeningy buněčných linií a klonů.
• Relativní profilování glykoform bez nutnosti absolutní kvantifikace stačí pro rozhodování o vhodnosti výrobní linky a sledování kvality.
• Integrace LC–TOF MS pipeline s glyco chip validací zvyšuje spolehlivost a důvěryhodnost výsledků při vývoji bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody na další třídy bioterapeutik (Fc-fúze, rekombinantní proteiny).
• Automatizace přípravy vzorků a integrace s pokročilými datovými platformami pro vyšší propustnost.
• Využití ion mobility MS a datově závislé akvizice (DIA) pro komplexnější profilování glykoform.
• Implementace strojového učení a AI pro automatizovanou interpretaci masových spekter a predikci glykánových struktur.

Závěr

Navržená LC–TOF MS metoda umožňuje rychlou, citlivou a spolehlivou charakterizaci glykozylace intaktního IgG1 a jeho Fc fragmentu během minut. Komplementární validace pomocí mAb-glyco chipu zvyšuje jistotu identifikace glykánů a podporuje efektivní vývoj, optimalizaci a kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

1. A. Lim, A. Reed-Bogan, B. J. Harmon. Anal. Biochem. 375, 163 (2008).
2. H. S. Gadgil, P. V. Bondarenko, G. D. Pipes, T. M. Dillon, D. Banks, J. Abel, G. R. Kleemann, M. J. Treuheit. Anal. Biochem. 355, 165 (2006).