N-Glycan analysis of monoclonal antibodies and other glycoproteins using UHPLC with fluorescence detection

Význam tématu

Správná analýza N-glykanů u monoklonálních protilátek a jiných glykoproteinů je klíčová pro zajištění účinnosti, bezpečnosti a konzistence bioterapeutik. Glykanový profil ovlivňuje afinitu k receptorům, aktivaci komplementového systému a cirkulační poločas v organismu. Navíc proměnlivost glykosylace je indikátorem kvality výroby a stability výrobku.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo optimalizovat a demonstrovat separaci a detekci N-glykanů derivatizovaných 2-aminobenzamidem pomocí UHPLC s HILIC fází a fluorescenční detekcí. Experiment se zaměřil na monoklonální protilátku standardního pufru, původem z mAb-Glyco Chip kitu, a dále na dvě avíární glykoproteiny z vaječného bílku – ovalbumin a conalbumin. Studie ověřuje rozlišení hlavních glykánových forem a komplexní profil složitějších glykanů z ptačích proteinů.

Použitá metodika a instrumentace

Glykany byly uvolněny enzymem PNGase F, následně značené 2-AB a očistěné HILIC SPE kartami. Rozdělení a detekce proběhly na Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC System spojeném s Agilent 1260 Infinity Fluorescence Detector. Pro potvrzení struktur a výpočet hmotností byla využita hyphenace na Agilent 6530 Accurate Mass Q-TOF MS.

• UHPLC systém Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC
• Autosampler a termostatovaná kolona
• Fluorescenční detektor 1260 Infinity s excitací 260 nm a emisí 430 nm
• HILIC Glycan Amide kolona 2.1×150 mm, částice <2 μm
• QTOF hmotnostní spektrometr Agilent 6530 Accurate Mass
• Software Agilent OpenLAB CDS a MassHunter Workstation

Hlavní výsledky a diskuse

Monoklonální protilátka vykázala optimální rozlišení pěti hlavních glykanů G0, G0F, Man5, (1,6)G1F a (1,3)G1F spolu se dvěma sialylovanými formami G2FS1 a G2FS2 při vysokém poměru signálu k šumu. U ovalbuminu a conalbuminu bylo v jednom místě glykozylace identifikováno více než 30 až 35 špiček, přičemž avíární glykanové formy neobsahovaly fukózu. Nastavení detekce na 260 nm místo standardních 330 nm přineslo výrazně vyšší citlivost a kvalitu dat.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysoké rozlišení, citlivou fluorescenční detekci a možnost hmotnostní verifikace glykanových forem. Je vhodná pro rutinní kontrolu kvality bioléků, charakterizaci glykoformních profilů v procesu vývoje léčiv a porovnávací studie mezi výrobními šaržemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další automatizace přípravy vzorků, miniaturizace HILIC fází, integrace s AI nástroji pro rychlou de novo analýzu glykanů a rozšíření databází retenčních časů a hmotností. Vývoj multiplexních metod pro simultánní analýzu více derivatizačních značek rovněž posílí rychlost a přesnost glykoanalýzy.

Závěr

UHPLC HILIC s fluorescenční detekcí poskytuje robustní platformu pro detailní profilaci N-glykanů u mAb a dalších glykoproteinů. Díky vysokému rozlišení, přesnému kvantitativnímu měření a možnosti hmotnostní verifikace je tento přístup ideální pro výzkum i průmyslové aplikace v biopharmaceutické analýze.

Reference

1. Rademacher TW Williams P a Dwek RA Agalaktosylované formy IgG auto protilátek jsou patologické Proceedings of the National Academy of Sciences 1994 91 6123–6127
2. Peracaula R a kol Glykozylace lidské pankreatické ribonukleázy: rozdíly mezi normálním a nádorovým stavem Glycobiology 2003 13 227–244
3. Jefferis R Glykozylace rekombinantních terapeutických protilátek Biotechnology Progress 2005 21 11–16
4. Arnold JN a kol Glykozylace lidských imunoglobulinů a aktivace komplementu Advances in Experimental Medicine and Biology 2005 564 27–43
5. Fernandes D Porovnání glykozylace protilátek v bioprodukci European Biopharmaceutical Review 2005 Summer 106–110
6. Abès R a Teillaud JL Dopad glykozylace na efektorové funkce terapeutických IgG Pharmaceuticals 2010 3 146–157
7. Ruhaak LR a kol Strategie značení glykanů a jejich využití v identifikaci a kvantifikaci Analytical and Bioanalytical Chemistry 2009 397 3457–3481
8. Royle L a kol HPLC analýza sérových N-glykanů na 96-jamkové platformě s databází Analytical Biochemistry 2008 376 1–12
9. Huhn C a kol Analýza glykozylace IgG Proteomics 2009 9 882–913
10. Melmer G a kol HILIC analýza fluorescenčně značených N-glykanů z rekombinantních bioterapeutik Analytical and Bioanalytical Chemistry 2010 398 905–914
11. Anumula KR Pokroky ve fluorescenční derivatizaci pro HPLC analýzu glykoproteinů Analytical Biochemistry 2006 350 1–23
12. Harvey DJ a kol Složení N-glykanů z ovalbuminu a souběžných glykoproteinů American Society of Mass Spectrometry 2000 11 564–571
13. Iwase H a Hotta K Subfrakcionace ovotransferrinu závislá na rozdílech v sacharidovém řetězci The Journal of Biological Chemistry 1977 252 5437–5443
14. Montreuil J Vliegenthart JFG a Schachter H Glycoproteins II Elsevier 1997