Direct Detection of Glutathione Conjugates in Human Liver Microsomes Using ACQUIT Y UPLC I-Class, Xevo G2-S QTof, and UNIFI

Význam tématu

Zachycení a charakterizace reaktivních metabolitů zásadně přispívá ke snížení rizika toxických účinků u nových léčiv.
Monitoring aduktů glutathionu pomáhá identifikovat reaktivní intermediáty, které mohou haptenizovat proteiny a vyvolat nežádoucí účinky.

Cíle a přehled studie

Tato studie se zaměřila na simultánní detekci původní látky, metabolitů fáze I a fázových GSH konjugátů v inkubátech lidských jaterních mikrozomů použitím generického MS E akvizičního režimu.
Modelovým sloučením byl antipsychotik clozapin, inkubovaný v přítomnosti a bez přítomnosti GSH a cytosolu během 2 hodin s odběry po 15 minutách.

Použitá metodika a instrumentace

In vitro inkubace:

• 10 μM clozapinu v mikrozomech (1 mg/mL) s GSH (5 mM) a/nebo cytosolem (1 mg/mL)
• Teplota 37 °C, vzorky odebírány po 15 minutách
• Fázové zastavení reakcí acetonitrilem, centrifugace a injekce na UPLC

Chromatografická separace:

• ACQUITY UPLC I-Class s BEH C18 2.1×100 mm, 1.7 μm, 60 °C
• Gradient 0–60 % B/6 min, 60–90 % B/2 min, udržení 90 % 1 min, návrat na 0 % B
• Mobilní fáze A: voda + 0.1 % kyseliny mravenčí, B: acetonitril + 0.1 % kyseliny mravenčí

Spectrometrie hmotnosti:

• Xevo G2-S QTof, ESI+ MS E (50–1200 m/z)
• Low CE 2 eV, high CE ramp 10–30 eV
• Automatická dekonvoluce nábojových stavů v UNIFI pro dvojmocné adukty GSH

Hlavní výsledky a diskuse

V inkubátech s GSH bylo detekováno 12 metabolitů: 6 fáze I a 6 GSH aduktů. Fáze I metabolity se vyskytovaly převážně jako jednonásobně nabité ionty, zatímco GSH konjugáty téměř výhradně jako dvojnásobně nabité. Automatická dekonvoluce nábojů umožnila spolehlivou detekci aduktů, které by jinak zůstaly nepozorovány. Kvantitativní trendy ukázaly pokles clozapinu a souběžný nárůst metabolitů až do přibližně 40 % konverze po 90 minutách.

Přínosy a praktické využití metody

Generický MS E akviziční režim s automatickou dekonvolucí nábojů zjednodušuje workflow pro screening reaktivních metabolitů.
Metoda umožňuje komplexní sledování původní sloučeniny a jejích fáze I a II produktů v jednom experimentu, což zrychluje hodnocení metabolické stability a toxikologického rizika.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace HRMS akvizice a pokročilé softwarové analýzy míří k automatizaci a vyšší citlivosti při odhalování i velmi nízkých hladin reaktivních aduktů.
Rozšíření metody na další typy pastiacích reagentů a adaptace na kvantitativní screening v preklinickém vývoji.

Závěr

Popsaná metoda představuje efektivní nástroj pro simultánní detekci mateřské látky, primárních metabolitů a reaktivních GSH aduktů. Automatická dekonvoluce nábojů a univerzální MS E akvizice zvyšují citlivost a spolehlivost screeningových studií v časné fázi vývoje léčiv.

Reference

1. Ma L. et al. Rapid screening of glutathione-trapped reactive metabolites by linear ion trap mass spectrometry with isotope pattern-dependent scanning and post acquisition data mining. Chem. Res. Toxicol., 2008, 21, 1477–1483
2. Zhu X. et al. Enhanced screening of glutathione-trapped reactive metabolites by in-source collision-induced dissociation and extraction of product ion using UHPLC-high resolution mass spectrometry. Anal. Chem., 2011, 83, 9516–9523
3. Liao S. et al. High-throughput screening for glutathione conjugates using stable-isotope labeling and negative electrospray ionization precursor-ion mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spec., 2012, 26, 659–669
4. Ma S., Chowdhury S.K. Data acquisition and data mining techniques for metabolite identification using LC coupled to high-resolution MS. Bioanalysis, 2013, 5, 1285–1297
5. Williams D.P. et al. Neutrophil cytotoxicity of the chemically reactive metabolite(s) of clozapine: possible role in agranulocytosis. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1997, 283, 1375–1382
6. Rea V. et al. Role of residue 87 in the activity and regioselectivity of clozapine metabolism by drug-metabolizing CYP102A1 M11H: application for structural characterization of clozapine GSH conjugates. Drug Metab. Dispos., 2011, 39, 2411–2420