Detection and identification of isotope-labeled glutathionetrapped reactive drug metabolites

Význam tématu

Studium metabolické osudy léků je klíčové pro posouzení jejich bezpečnosti a efektivity. Zachycování reaktivních metabolitů pomocí glutathionu (GSH) patří mezi základní postupy v rané fázi vývoje, protože identifikuje látky potenciálně toxické. Vysokorozlišující hmotnostní spektrometrie (HRAM) v kombinaci s LC umožňuje detekci a strukturní charakterizaci těchto konjugátů s vysokou citlivostí a selektivitou.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo demonstrovat integrovaný přístup pro rychlou a spolehlivou identifikaci isotopově značených GSH konjugátů reaktivních metabolitů. Modelovou sloučeninou se stal antipsychotikum clozapin inkubované s mikrozomy jater. Metabolity byly zachyceny směsí neoznačeného a [13C2,15N] značeného GSH v poměru 1:1 a analyzovány pomocí LC-HRMS a pokročilé softwarové analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Inkubační podmínky:

• Clozapin 10 µM, mikrozomy potkaních jater 1 mg/mL, NADPH 1 mM
• GSH/[13C2,15N]-GSH 5 mM
• Ukončení reakce acetonitrilem s 0,1 % kyselinou mravenčí, srážení bílkovin
• Reverzní fázová chromatografie na C18 kolonce (2,5 µm, 100×2,1 mm)

MS parametry:

• Orbitrap Exploris 240 MS, pozitivní režim, Full MS ddMS2
• Rozlišení 120 000 @ m/z 200 (full scan), 30 000 @ m/z 200 (MS2)
• Interní kalibrace EASY-IC, HCD s kročkovaným kolizním napětím 20/30/50 %

Software:

• Compound Discoverer 3.3 SP3 – uzlová workflow pro očekávané a neočekávané metabolity
• Moduly: Generate Expected Compounds, Pattern Scoring, Search Neutral Losses, FISh Scoring, Differential Analysis

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekce osmi očekávaných GSH konjugátů clozapinu a jednoho neočekávaného pomocí kombinace cíleného a necíleného přístupu
• Pattern Scoring node zaflagoval dvojice iontů se zátěží 3,0037 Da odpovídající značenému GSH
• Search Neutral Losses node identifikoval charakteristický rozpad s úbytkem pyroglutamátu (m/z 129,0425)
• FISh Scoring umožnil automatickou anotaci fragmentů a upřesnění polohy oxidace či místa konjugace
• Filtrace výsledků snížila počet potenciálních složek z tisíců na stovky a ulehčila ruční ověřování

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší selektivita a citlivost díky kombinaci stabilně značeného GSH a HRAM MS/MS
• Rychlá dataří a vyhodnocení v jednom softwaru zkracuje dobu analýzy
• Strukturní informace podporují optimalizaci vedoucích sloučenin v raných fázích vývoje
• Workflow je přizpůsobitelný pro jiné malé molekuly a značkovací strategie

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace pokročilých algoritmů strojového učení pro automatizovanou interpretaci MS dat
• Rozšíření workflow o další izotopové značení a modifikace
• Propojení se systémy LIMS a cloudovými platformami pro škálovatelné zpracování dat
• Využití v toxikologii a metabolomice pro komplexní profilování biologických vzorků

Závěr

Propojením Orbitrap Exploris 240 MS s inteligentními nástroji Compound Discoverer bylo dosaženo efektivní a spolehlivé identifikace isotopově značených GSH konjugátů reaktivních metabolitů clozapinu. Workflow nabízí vysokou kvalitu dat, snižuje počet falešně pozitivních výsledků a je snadno adaptovatelný na široké spektrum aplikací v analytické chemii a farmaceutickém výzkumu.

Reference

1. Wang Z. et al. Rapid screening and characterization of glutathione-trapped reactive metabolites using a polarity switch-based approach on a high-resolution quadrupole orbitrap mass spectrometer. Anal Bioanal Chem. 2017;409(18):4273–4283. doi:10.1007/s00216-017-0814-8
2. Zhu Y. et al. Enhanced Screening of Glutathione-Trapped Reactive Metabolites by In-Source Collision-Induced Dissociation and Extraction of Product Ion Using UHPLC-High Resolution Mass Spectrometry. Anal Chem. 2011;83(24):9516–9523. doi:10.1021/ac202280f
3. Ma T. et al. Rapid Screening of glutathione-trapped reactive metabolites by linear ion trap mass spectrometry with isotope pattern-dependent scanning and post-acquisition data mining. Chem Res Toxicol. 2008;21(7):1477–1483.
4. Mutlib AE. et al. Application of stable isotope labeled glutathione and rapid scanning mass spectrometers in detecting and characterizing reactive metabolites. Rapid Commun Mass Spectrom. 2005;19(26):3482–3492.
5. Thermo Fisher Scientific. Confident drug metabolite identification using an intelligent data acquisition and processing workflow. Application Note 65953.
6. Thermo Fisher Scientific. Detection and identification of labeled compounds from high resolution tandem mass spectrometry. Poster Note 64747.