High Mass Loading of Peptides with Hybrid Particle C18 Columns and Acetic Acid Mobile Phases

Význam tématu

Peptidová preparativní chromatografie s reverzní fází je zásadní pro purifikaci terapeutických peptidů a výzkumných markerů. Vysoká chromatografická rozlišení minimalizují soueluci příbuzných nečistot a optimalizují produktivitu díky vynikající zatížitelnosti kolon.

Cíle a přehled studie / článku

Studie hodnotí výkonnost dvou hybridních C18 stacionárních fází BEH130 C18 a CSH130 C18 při vysokých hmotnostních náložích peptidů. Porovnává efekty mobilních fází modifikovaných 0,1 % TFA a optimalizovanými koncentracemi kyseliny octové (HOAc) s důrazem na šířku píků, rozlišení a selektivitu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: směs devíti peptidů MassPREP a nízkopurity syntetický peptid DFVGYGVKDFVGVGVK připravené v mobilních fázích obsahujících TFA nebo HOAc.
Chromatografický systém: ACQUITY UPLC H-Class Bio System s 20 cm ohřívačem kolony a detektorem ACQUITY UPLC TUV.
Kolony: XBridge BEH130 C18 4,6×100 mm 5 µm 130 Å a XSelect CSH130 C18 4,6×100 mm 5 µm 130 Å.
Mobilní fáze: voda a acetonitril modifikované 0,1 % TFA nebo HOAc v koncentracích 0,1 až 1 % a odpovídající gradienty.
Detekce: UV při 214 a 250 nm, MS infuze do Xevo G2 Q-Tof s elektrospray ionizací.
Software: MassLynx v4.1.

Hlavní výsledky a diskuse

Při semi-preparativních náložích devíti komponentové směsi poskytla CSH130 C18 s 0,1 % HOAc šířku píků srovnatelnou s TFA a výrazně užší než BEH130 C18 s HOAc. BEH130 C18 vykazoval při 0,1 % HOAc značné rozšíření píků. CSH130 C18 prokázala vynikající tvar píků i při vysoké zátěži až 20násobné oproti analytickým náložím. U syntetického peptidu DFVGYGVKDFVGVGVK bylo zjištěno, že optimální šířku píků obstaraly BEH130 C18 při 0,1 % HOAc a CSH130 C18 při 1 % HOAc. Obě fáze v mobilních fázích s HOAc překonaly TFA v užší šířce píků a lepším rozlišení nečistot.

Přínosy a praktické využití metody

Kyselina octová přináší farmaceuticky přijatelné protinióny a eliminuje nutnost výměny TFA soli. Hybridní C18 kolonky zvyšují zatížitelnost a stabilitu, umožňují vyšší produktivitu a čistotu frakcí. Volba optimální koncentrace HOAc pro různé chemistrie rozšiřuje flexibilitu při vývoji purifikačních procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování zahrnuje optimalizaci středních koncentrací HOAc pro specifické peptidy, přenos metodiky na větší průtočné objemy a širší spektrum molekulárních hmotností. Příležitosti leží rovněž v kontinuální chromatografii a automatizovaných platformách pro purifikaci.

Závěr

Study prokázala, že hybridní C18 sloupce BEH130 C18 a CSH130 C18 jsou vhodné pro vysokonáložní preparativní peptidovou chromatografii. Hlavní přínos spočívá v možnosti použití farmaceuticky přijatelné kyseliny octové, dosažení úzkých píků, vysokého rozlišení nečistot a zvýšené produktivity.

Reference

1. Cornish J Callon KE Lin CQ Xiao CL Mulvey TB Cooper GJ Reid IR Trifluoroacetate a contaminant in purified proteins inhibits proliferation of osteoblasts and chondrocytes Am J Physiol 1999 277 5 E779 E783
2. Pini A Lozzi L Bernini A Brunetti J Falciani C Scali S Bindi S Di Maggio T Rossolini GM Niccolai N Bracci L Efficacy and toxicity of the antimicrobial peptide M33 produced with different counter ions Amino Acids 2012 43 1 467 473
3. Reichert JP Tartat A Dunn MK Development trends for peptide therapeutics A comprehensive quantitative analysis of peptide therapeutics in clinical development Peptide Therapeutics Foundation 2010
4. Fields GB Carr SA Marshak DR Smith AJ Stults JT Williams LC Williams KR Young JD In Techniques in Protein Chemistry IV Hogue Angeletti R Ed San Diego 1993 229 237
5. Kent SBH Chemical Synthesis of Peptides and Proteins Ann Rev Biochem 1988 57 957 989
6. Roux S Zekri E Rousseau B Paternostre M Cintrat JC Fay N Elimination and exchange of trifluoroacetate counter ion from cationic peptides a critical evaluation of different approaches J Pept Sci 2008 14 3 354 359
7. Alon H Butilca GM Eidelman C Elster S Ivchenko A Shusman S Tovi A Zaoui GA Counterion Exchange Process for Peptides Patent Pending 2006 2010
8. Lauber MA Koza SM Fountain KJ Peptide Mapping and Small Protein Separations with Charged Surface Hybrid C18 and TFA Free Mobile Phases Waters Application Note 720004571en 2013 January
9. Lauber MA Koza SM Fountain KJ Increasing Peak Capacity in Reversed Phase Peptide Separations with Charged Surface Hybrid C18 Columns Waters Application Note 720004568en 2013 January
10. Gritti F Guiochon G Adsorption behavior of the three species of the biprotic peptide Phe Ala onto an end capped C18 bonded organic inorganic hybrid stationary phase Anal Chem 2009 81 24 9871 9884