Increasing Peak Capacity in Reversed-Phase Peptide Separations with Charged Surface Hybrid (CSH) C18 Columns

Význam tématu

Reversed-phase chromatografie peptidů je klíčová pro bottom-up proteomiku a charakterizaci biofytofámaceutik. Hlavním ukazatelem výkonu je peak capacity, neboli maximální počet chromatografických špiček ve stanoveném gradientním čase. Modifikace stacionární fáze, jako je Charged Surface Hybrid (CSH) C18, mohou významně zlepšit tvar špiček, retenci i kompatibilitu s hmotnostní spektrometrií.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat výkonnost sloupků CSH130 C18 (1,7 µm) s běžnými C18 fázemi (BEH130 C18, superficially porous 1,7 µm a 5 µm) při separaci modelové devítipeptidové směsi MassPREP. Hodnocena byla peak capacity, tvar píků, selektivita, závislost na kyselinových modifikátorech (TFA vs. FA) a kompatibilita s MS. Dále se ověřila přenositelnost metody na HPLC kolónu 2,5 µm XP.

Použitá metodika a instrumentace

• LC: Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio System s topnými moduly 150/250 mm
• Kolóny: CSH130 C18 (1,7 µm, 130 Å), BEH130 C18 (1,7 µm), superficially porous C18 (1,7 µm), komparativní C18 (5 µm, 300 Å), CSH130 C18 XSelect XP (2,5 µm)
• Detekce: UPLC TUV (214 nm), Xevo G2 QTof MS, ESI+, m/z 50–1990, scan rate 10 Hz
• Mobilní fáze: A: 0,1 % FA/H₂O; B: 0,1 % FA/ACN; C: 0,1 % TFA/H₂O; D: 0,1 % TFA/ACN, gradient 2→50 % ACN za 60 min při 0,3 mL/min
• Vzorek: MassPREP Peptide Mixture (9 peptidů), 0,6 mg/mL

Hlavní výsledky a diskuse

• CSH130 C18 vykázala nejlepší tvar píků u FA i TFA mobilních fází a unikátní selektivitu, zejména při 0,1 % FA, kde byly peptidy 8 a 9 plně rozlištěné.
• Retence byla u CSH o 2–4 % nižší díky elektrostatickému odpuzování kladně nabitých peptidů od povrchu kolony.
• Peak capacity: +20 % při 0,1 % TFA a až +90 % při 0,1 % FA ve srovnání s ostatními 1,7 µm C18.
• MS signál klesal až 12× při použití TFA; CSH nevyžaduje TFA pro optimální peak capacity, což zlepšuje citlivost LC-MS.
• Přenos metody na HPLC 2,5 µm XP kolonu: zachována selektivita, nižší zpětný tlak (~3000 vs. ~8000 psi) při 1,5× delším gradientu.

Přínosy a praktické využití metody

CSH130 C18 umožňuje vysokou rozlišovací schopnost peptide separací bez silného iontového párování, snadnou integraci s MS pro vyšší citlivost a je vhodná pro UPLC i standardní HPLC instrumentaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace podmínek pro velmi polární a větší polypeptidy
• Integrace s vysokorozlišovacími hmotnostními spektrometry
• Vývoj Quality by Design metod pro rychlejší validaci
• Automatizace a škálovatelné workflow pro průmyslové laboratoře a QA/QC

Závěr

Charged Surface Hybrid CSH130 C18 kolony s nízkolevelovým kladným nábojem poskytují vyšší peak capacity, lepší tvar špiček a jedinečnou selektivitu při nižší závislosti na TFA, což výrazně zlepšuje citlivost a robustnost RP separací peptidů a umožňuje snadnou přenositelnost mezi UPLC a HPLC.

Reference

1. Yates JR, Ruse CI, Nakorchevsky A. Proteomics by mass spectrometry: approaches, advances, and applications. Annu Rev Biomed Eng. 2009;11:49–79.
2. Richardson J, Shah B, Xiao G, Bondarenko PV, Zhang Z. Automated in-solution protein digestion using a commonly available high-performance liquid chromatography autosampler. Anal Biochem. 2011;411(2):284–91.
3. Neue UD. Theory of peak capacity in gradient elution. J Chromatogr A. 2005;1079(1-2):153–61.
4. Wyndham KD, et al. Characterization and evaluation of C18 HPLC stationary phases based on ethyl-bridged hybrid organic/inorganic particles. Anal Chem. 2003;75(24):6781–8.
5. Iraneta PC, et al. Charged Surface Hybrid (CSH) Technology and Its Use in Liquid Chromatography. Waters White Paper. 2011.
6. Berthelette KD, Summers M, Fountain KJ. Modernization of the USP Assay for Clarithromycin Using eXtended Performance (XP) Column Technology. Waters Application Note. 2012.
7. Fountain KJ, et al. Practical Applications of Charged Surface Hybrid (CSH) Technology. Waters Application Note. 2010.
8. Summers M, Fountain KJ. A Quality by Design (QbD) Based Method Development for the Determination of Impurities in a Peroxide Degraded Sample of Ziprasidone. Waters Application Note. 2011.
9. Summers M, Fountain KJ. Rapid Method Development through Proper Column Selection. Waters Application Note. 2012.
10. Waters Applications Notebook: ACQUITY UPLC CSH Columns. 2010.
11. Lauber MA, Koza SM, Fountain KJ. Peptide Mapping and Small Protein Separations with CSH C18 and TFA-Free Mobile Phases. Waters Application Note. 2013.
12. Yan B, et al. Human IgG1 hinge fragmentation as the result of H2O2-mediated radical cleavage. J Biol Chem. 2009;284(51):35390–402.
13. Yu XC, et al. Accurate determination of succinimide degradation products using high fidelity trypsin digestion peptide map analysis. Anal Chem. 2011;83(15):5912–9.
14. Annesley TM. Ion suppression in mass spectrometry. Clin Chem. 2003;49(7):1041–4.
15. Temesi D, Law B. LC-GC Int. 1999;17:626–32.
16. Apffel A, et al. Enhanced sensitivity for peptide mapping with electrospray liquid chromatography–mass spectrometry in the presence of signal suppression due to trifluoroacetic acid-containing mobile phases. J Chromatogr A. 1995;712(1):177–90.
17. Kuhlmann FE, et al. J Am Soc Mass Spectrom. 1995;6(12):1221–5.
18. Jones MD, Alden P, Fountain KJ, Aubin A. Waters Application Note. 2010.