Peptide Mapping and Small Protein Separations with Charged Surface Hybrid (CSH) C18 and TFA-Free Mobile Phases

Význam tématu

Peptidové mapování je základní technikou pro charakterizaci biopharmaceutik a kontrolu kvality proteolytických vzorků. Tradičně se při této metodě využívají mobilní fáze s trifluoroctovou kyselinou (TFA), která sice zlepšuje tvar píků, avšak výrazně potlačuje signál v ESI-MS. Použití slabšího iontově párovacího činidla, jako je kyselina mravenčí (FA), vyžaduje sloupce s nezávislostí na silných párovacích činidlech a nabízí citlivější detekci hmotnostní spektrometrií.

Cíle a přehled studie

Studie porovnává novou stacionární fázi Charged Surface Hybrid (CSH) C18 s konvenčními BEH C18 a superficially porous C18 sloupci při separaci tryptických peptidů z enolázy a při rozlišení polypeptidů do 12 kDa. Cílem bylo ověřit, zda CSH130 C18 umožní vysokou peak capacity i při použití FA mobilních fází a jak si vede u větších peptidů a malých proteinů.

Použitá instrumentace

• Chromatografický systém: Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio System s termostatovanou kolonkou (40 °C) a autosamplerem (10 °C)
• Mass spektrometr: Xevo G2 Q-Tof v režimu ESI+ s rozlišením a scan rate 10 Hz
• Sloupce: ACQUITY UPLC CSH130 C18 (1,7 µm, 130 Å), BEH130 C18 (1,7 µm, 130 Å), BEH300 C18 (1,7 µm, 300 Å), superficially porous C18 (1,7 µm, 100 Å)
• Vzorky: MassPREP Enolase Digestion Standard; směs velkých peptidů a malých proteinů (1–12 kDa) v 0,1 % FA ve vodě
• Válce: LCGC Certified Clear Glass Qsert Vial

Hlavní výsledky a diskuse

• Peak capacity: CSH130 C18 s FA dosáhl hodnoty 532, což představuje nárůst o ~30 % oproti BEH130 (399) a superficially porous C18 (405).
• Selektivita a retence: CSH130 C18 vykázal odlišné pořadí elučních časů peptidů, přičemž polarita a náboj peptidů ovlivňovaly jejich interakci s povrchem sloupce.
• Separace velkých peptidů a malých proteinů: CSH130 C18 nabídl nejlepší tvar píků pro druhy až do ~6 kDa (např. insulin). Pro větší proteiny (ubiquitin, cytochrom c) dosáhl BEH300 C18 mírně lepšího rozlišení díky větším pórům.
• Citlivost MS: Použití FA mobilních fází s CSH130 C18 minimalizovalo iontovou supresi a umožnilo citlivější detekci oproti TFA.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda s CSH130 C18 umožňuje vysokou kapacitu a citlivost LC-MS peptidového mapování bez nutnosti silných iontově párovacích činidel. Výsledky ukazují, že je vhodná pro rutinní QC biopharmak, analýzu terapeutických inzulinů i detailní charakterizaci peptidů v komplexních směsích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace mobilních fází pro ještě širší rozsah kyselin a pufrů šetrných k MS.
• Rozvoj povrchově modifikovaných fází cílených na specifické posttranslační modifikace peptidů.
• Integrace s vysokorychlostními a multidimenzionálními LC systémy pro komplexní proteomické aplikace.

Závěr

Nová CSH130 C18 stacionární fáze prokázala v kombinaci s FA mobilními fázemi vynikající výkon pro peptidové mapování i separaci malých proteinů. Nabízí vyšší peak capacity, unikátní selektivitu řízenou povrchovým nábojem a lepší citlivost v LC-MS analýzách než tradiční C18 materiály.

Reference

1. Kuhlmann FE et al. J Am Soc Mass Spectrom. 1995;6(12):1221–1225.
2. Apffel A et al. J Chromatogr A. 1995;712(1):177–190.
3. Chakraborty AB, Berger SJ. J Biomol Tech. 2005;16(4):327–335.
4. Annesley TM. Clin Chem. 2003;49(7):1041–1044.
5. Temesi D, Law B. LC-GC Int. 1999;17:626–632.
6. Lauber MA et al. Waters Application Note 720004568EN. 2013.
7. Chambers EE et al. Bioanalysis. 2013;5(1).
8. Gillece-Castro BL et al. Waters Application Note 720001792EN. 2011.