GlycoWorks Sample Preparation Consumables

Význam tématu

Glykozylace představuje klíčovou posttranslační modifikaci eukaryotických proteinů, přičemž 50–70 % lidských proteinů je glykosylovaných. Glykanové struktury ovlivňují imunitní odpověď, srážení krve, buněčný vývoj a smrt.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje GlycoWorks Sample Preparation Solution od Waters jako komplexní řešení pro izolaci, čištění a analýzu N-vázaných glykánů. Cílem je zkrátit čas přípravy vzorku, zajistit kvantitativní výtěžky a umožnit snadnou integraci s chromatografií a softwarovými nástroji.

Použitá metodika a instrumentace

• Denaturace glykoproteinů s RapiGest a redukce/alkylace (DTT/IAM).
• Enzymatická deglykozylace N-vázaných oligosacharidů pomocí PNGase F.
• Čištění uvolněných glykánů metodou HILIC SPE (GlycoWorks HILIC µElution Plate nebo 1 cc cartridge).
• Derivace fluorescenčním značením 2-AB a odstranění přebytku činidla pomocí HILIC SPE.
• Separace a detekce pomocí HILIC UPLC-FLR (ACQUITY UPLC BEH Glycan Column) s volitelnou podporou MS (Xevo G2-S QTof).
• Data processing v Empower 3 nebo UNIFI 1.6/1.7 s využitím GlycoBase databáze a kalibrace na glukózové jednotky (GU) pomocí 2-AB Dextran Calibration Ladder.
• Automatizace preparace vzorku s Positive Pressure-96 Processor.

Hlavní výsledky a diskuse

• Test standardu 2-AB značených glykánů (3 pmol) potvrdil kvalitní separaci očekávaných špiček a nízký podíl neočekávaných komponent.
• Porovnání µElution Plate a single-use 1 cc cartridge ukázalo konzistentní profil glykánů (< 5 % RSD) a uniformní průtok.
• Optimalizovaná SPE a reagens přinesly kvantitativní a reprodukovatelné výtěžky různých N-glykánů.
• BEH Glycan kolony ve velikostech 1.7, 2.5 a 3.5 µm zajistily škálovatelnost mezi UPLC a HPLC aplikacemi při zachování vysoké kvality separace.
• Software Empower/UNIFI umožnil automatickou identifikaci a kvantifikaci vzorků v GU s použitím GlycoBase.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní workflow s předpřipravenými reagens a standardy pro vysokou reproducibilitu.
• Podpora vysokoprůtokových i jednorázových formátů s minimem manuálních kroků.
• Vhodné pro výzkumné laboratoře, QA/QC procesy i biotechnologickou výrobu glykoproteinů.
• Kompatibilita s existujícími LC-FLR/MS platformami a univerzálním softwarem pro zpracování dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další automatizace a miniaturizace pracovních postupů (mikrofluidní SPE systémy).
• Nové fluorescenční a ionizační derivační činidla s vyšší citlivostí a selektivitou.
• Propojení real-time MS technik s UPLC-MS/MS pro detailní strukturální analýzu.
• Nasazení AI a strojového učení pro predikci glykánových profilů a zrychlení interpretace dat.
• Rozšíření glykanových databází pro klinické diagnostické a terapeutické aplikace.

Závěr

Waters GlycoWorks Sample Preparation Solution nabízí robustní a uživatelsky přívětivé řešení pro přípravu a analýzu N-vázaných glykánů. Integrace optimalizovaných reagens, HILIC SPE, derivace, UPLC-FLR/MS detekce a pokročilého softwaru zaručuje vysokou kvalitu, opakovatelnost a vhodnost pro široké spektrum analytických aplikací.

Reference

1. Lauber MA, Koza S, Fountain KJ. Optimization of HILIC SPE for the Quantitative and Robust Recovery of N-Linked Glycans. Waters Application Note 720004710EN. 2013.
2. Lauber MA, Koza S, Fountain KJ. Single-Use and High-Throughput HILIC SPE Device Formats and an IgG Control Standard for Facilitating N-Glycan Analyses. Waters Technology Brief 720004711EN. 2013.
3. Waters Corporation. Glycan Standards Training Video. 2013.
4. Waters Application Note 720004660EN. GlycoWorks Sample Preparation Protocol for MALDI. 2013.