Amide-Bonded BEH HILIC Columns for High Resolution, HPLC-Compatible Separations of N-Glycans

Význam tématu

Glykanová modifikace bioterapeutických proteinů zásadně ovlivňuje jejich léčebné vlastnosti, imunitní odpověď i stabilitu výrobního procesu. Spolehlivé a vysoce rozlišující postupy pro analýzu N-glykosidických struktur jsou proto klíčové pro výzkum, vývoj i rutinní QC/QC laboratoře.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované studie bylo vyhodnotit amide-bonded BEH HILIC kolonky s různými velikostmi částic (1,7; 2,5 a 3,5 μm) pro separaci 2-AB značených N-glykanů a demonstrovat škálovatelnost metod mezi UPLC a HPLC přístroji. Dále se zkoumala konzistence glykanových profilů a přidružených GU hodnot.

Použitá metodika

Pro test separace byl použit Glycan Performance Test Standard (2-AB značené N-glykany z lidského séra IgG spojené s A3 trisialylovanými glykany). Separace probíhala v režimu HILIC-FLR s mobilními fázemi 100 mM amonného formiátu (pH 4,4) a acetonitrilu. Pro srovnání byly použity kolony ACQUITY UPLC BEH Glycan 1,7 μm, XBridge BEH Glycan 2,5 μm XP a XBridge BEH Glycan 3,5 μm. Pro HPLC kompatibilitu byly metody škálovány úpravou lineární rychlosti a doby gradientu podle průměru částic.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class Bio System
• Alliance HPLC System (Waters 2695 HPLC)
• ACQUITY UPLC BEH Glycan Column, 1,7 μm, 2,1×150 mm
• XBridge BEH Glycan Column, 2,5 μm XP, 2,1×150 mm
• XBridge BEH Glycan Column, 3,5 μm, 2,1×150 mm
• FLR detektor (Ex 330 nm, Em 420 nm)
• Dextran Calibration Ladder Standard (2-AB značený)
• Glycan Performance Test Standard (2-AB značený)

Hlavní výsledky a diskuse

Kolonka 1,7 μm dosáhla nejvyšší kapacity (~158) při tlaku až 8700 psi, zatímco kolony 2,5 μm XP a 3,5 μm pracovaly při 4600, resp. 1800 psi a poskytly kapacity 135 a 105, přičemž překonaly konkurenční 3 μm silikátovou AMIDE kolonku. Škálované metody na HPLC přístrojích zachovaly srovnatelnou selektivitu (α faktor 1,2–1,6) a umožnily významné rozlišení i mezi strukturálně podobnými glykany (G1FN vs Man6). Relativní zastoupení glykanů bylo konzistentní do ±10 % (výjimkou byla nižší rozlišení 8. a 9. píku na 3,5 μm koloně). GU hodnoty získané na všech kolonkách se lišily maximálně o 0,05, což je v rámci experimentální odchylky.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost snadné migrace mezi UPLC a HPLC bez změny stacionární fáze
• Vyšší rozlišení glykanů a zlepšená kapacita oproti běžným silikátovým HILIC kolonám
• Kompatibilita s existujícími laboratorními HPLC systémy díky větším částicím
• Konzistentní a reprodukovatelné GU hodnoty pro spolehlivou identifikaci glykanů
• Užitečné pro kvalitativní i kvantitativní profilování glykozylace v biotechnologii

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší nasazení škálovatelných glykanových metod v regulovaných QC laboratořích, integrace s hmotnostní spektrometrií pro další úroveň charakterizace a vývoj dalších derivatizovaných stacionárních fází pro pokročilé aplikace v glykoproteomice. Automatizace přípravy vzorků a datové analýzy dále zvýší throughput.

Závěr

Amide-bonded BEH HILIC kolony se 1,7, 2,5 a 3,5 μm částicemi umožňují flexibilní a vysoce rozlišující separaci N-glykanů s konzistentními profily a GU hodnotami. Metody lze efektivně přenášet mezi UPLC a HPLC přístroji, což usnadňuje implementaci v laboratořích s různou infrastrukturou.

Reference

1. Beck A.; Wagner-Rousset E.; Ayoub D.; Van Dorsselar A.; Sanglier-Cianferani S. Characterization of Therapeutic Antibodies and Related Products. Anal Chem 2013, 85, 715–736.
2. Kaneshiro K.; Watanabe M.; Terasawa K.; Uchimura H.; Fukuyama Y.; Iwamoto S.; Sato T. A.; Shimizu K.; Tsujimoto G.; Tanaka K. Rapid quantitative profiling of N-glycan by the glycan-labeling method. Anal Chem 2012, 84, 7146–7151.
3. Ahn J.; Bones J.; Yu Y. Q.; Rudd P. M.; Gilar M. Separation of 2-aminobenzamide labeled glycans using HILIC columns packed with 1.7 μm sorbent. J Chromatogr B 2010, 878, 403–408.
4. Yu Y. Q.; Ahn J.; Gilar M. Trastuzumab Glycan Batch-to-Batch Profiling using a UPLC/FLR/MS Platform. Waters App Note 2010.
5. Campbell M. P.; Royle L.; Radcliffe C. M.; Dwek R. A.; Rudd P. M. GlycoBase and autoGU: tools for HPLC-based glycan analysis. Bioinformatics 2008, 24, 1214–1216.