GlycoWorks Sample Preparation Protocol For MALDI

Význam tématu

Analýza sacharidů (glykanů) je klíčová pro pochopení struktury a funkce glykoproteinů v biomedicíně, farmaceutickém vývoji i kvalitativní kontrole biotechnologických produktů. Před hmotnostní spektrometrickou (MS) analýzou je nezbytné účinně odstranit soli, detergenty a další kontaminanty. GlycoWorks HILIC μElution Plate umožňuje selektivní obohacení a desaltaci hydrofilních analy­tů s elucí v minimálním objemu, čímž zrychluje workflow a zvyšuje citlivost MALDI MS měření.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem popsaného protokolu je představit komplexní postup vzorkové přípravy glykoproteinů až po obohacené a fluorescenčně značené glykany připravené k MALDI MS analýze. Hlavní kroky zahrnují denaturaci a deglycosylaci, extrakci glykánů pomocí HILIC μElution, značení FLR barvivem a konečnou přípravu vzorku pro MALDI. Protokol se zaměřuje na minimalizaci objemu eluátu, odstranění časově náročných kroků odpařování a zajištění přímé analýzy neodvozených sacharidů.

Použitá metodika

1) Denaturace a případná redukce/alkylace proteinů (RapiGest, DTT, IAM), následná deglycosylace enzymem PNGase F.
2) Extrakce uvolněných glykánů: kondicionace sorbentu vodou, ekvilibrace 90 % acetonitrilem ve vodě, nanesení vzorku (100–750 µL v 90 % acetonitrilu), praní (dva 200 µL 90 % acetonitrilu) a eluční kroky s 1 mM (nebo 10 mM pro silně sialylované glykany) Tris-citrátovým pufrem (2×50 µL nebo 2×25 µL pro vyšší koncentraci).
3) FLR značení glykánů pomocí redukční aminace.
4) Odstranění přebytků značicího činidla opět HILIC μElution Plate.
5) Příprava pro MALDI TOF MS: použití matrice DHB (20 mg/mL v etanolu), aplikace vzorku a tvorba homogenní krystalické vrstvy s přídavkem 0,8 µL etanolu.

Použitá instrumentace

• GlycoWorks HILIC μElution 96-well Plate a SPE Vacuum Manifold (Waters)
• SPE Vacuum Pump / Positive Pressure Manifold pro tok vzorku
• MALDI TOF hmotnostní spektrometr a MALDI target
• Volitelně LC-FLR a LC-FLR-MS systémy pro doplňující analýzu

Hlavní výsledky a diskuse

Protokol prokázal efektivní odstranění solí a detergentů s vysokým výtěžkem glykánů při objemu eluátu již od 25 µL, což odstraňuje nutnost odpařovacích kroků. Přímá MALDI analýza neodvozených glykánů poskytuje jasné a reprodukovatelné spektrální signály. Homogenní krystalizace DHB matice s přídavkem etanolu vede k lepší reprodukovatelnosti a konzistentní intenzitě píků.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby přípravy vzorku díky nízkému objemu eluce
• Účinná desaltace a odstranění detergentů
• Možnost přímé MALDI MS analýzy bez chemické derivatizace
• Vysoká propustnost i v 96-jamkovém formátu
• Kompatibilita s LC-FLR a LC-MS pro multidimenzionální analýzu

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další automatizace extrakčních procesů a integrace HILIC μElution do mikrofluidických platforem. Vývoj nových matric a vylepšení desorpce/ionizace podpoří citlivější detekci vzácných glykánů. Kombinace s vysokorozlišovacími MS nástroji a pokročilou bioinformatikou umožní detailní mapování glykovariabilit.

Závěr

Popsaný GlycoWorks protokol představuje robustní, rychlý a vysoce reprodukovatelný postup pro přípravu a analýzu glykánů. Minimalizuje manuální operace, redukuje ztráty vzorku a umožňuje přímou MALDI MS analýzu bez nutnosti časově náročné derivatizace.

Reference

• Waters Corporation. GlycoWorks Sample Preparation Protocol For MALDI, Application Note 720004660EN, April 2013.