Robustness of RapiFluor-MS N-Glycan Sample Preparations and Glycan BEH Amide HILIC Chromatographic Separations

Význam tématu

Profilování N-glykosylace proteinů je klíčové pro monitorování zdravotního stavu a kontrolu biotechnologické výrob­y léčivých protilátek. Tradiční postupy uvolňování a značení glyk­anů (např. 2-AB) bývají časově náročné a mohou sni­žit citlivost hromadné spektrometrie. Metoda založená na RapiFluor-MS značení a HILIC separaci nabízí vyšší průchodnost, citlivost a reprodukovatelnost.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl ověřit robustnost a opakovatelnost přípravy N-glykosylovaných vzorků pomocí sady GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit a chromatografických separací na BEH Amide HILIC kolónách. Autoři porovnali nové postupy s tradičními 2-AB metodami, zhodnotili výtěžnost, vliv parametrů značení, čištění a dlouhodobou robustnost kolón.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy zahrnoval:

• Denaturaci a rychlou deglykozylaci glykoproteinů (RapiGest SF, Rapid PNGase F, 90 °C/3 min + 50 °C/5 min).
• RapiFluor-MS značení N-glykozylaminů pH 7,9 v 5 min (optimální koncentrace zna­čidla 36 mM).
• HILIC SPE čistění pomocí µElution desek (optimální objem elu­tu 90 µl, výtěžnost ~74 %).
• Chromatografii na UPLC ACQUITY UPLC H-Class Bio systému s BEH Amide kolónami (130 Å, 1,7 µm).
• Detekci pomocí fluorescenční FLR a MS (QDa, Xevo G2-XS QTof, SYNAPT G2-Si HDMS) a software UNIFI/MassLynx.
• Kalibraci retencí na základě GU hodnot s novou RapiFluor-MS Dextran Calibration Ladder.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kompletní deglykozylace monoklonální protilátky potvrzena intact mass spektrem, bez vlivu prodloužené denaturace (90 °C/20 min).
• Doba přechodu glykozylaminů k nevýznamné hydrolýze (t1/2 ~2 h při 50 °C) zajišťuje minimální ztráty při značení.
• Optimalizace molárního nadbytku RapiFluor-MS zna­čidla pro maximální signál a robustnost v rozmezí 18–108 mM.
• Celkový výtěžek značených N-glyk­anů ~73 % (oproti ~35 % u 2-AB protokolu), s kvantitativní srovnatelností s teoretickými hodnotami.
• Nízká variabilita mezi výrobními šaržemi reagencií (RSD ≈2,3 %) a konzistentní glykanové profily.
• HILIC FLR chromatogramy pro RapiFluor-MS a 2-AB značení vykazují obdobnou selektivitu, avšak s posunem RT pro RapiFluor-MS, který lze snadno korigovat.
• Lifetime test kolóny (300 injekcí) ukázal stabilní retence a selektivitu; GU kalibrace minimalizuje fluktuace RT.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí zkrácení doby přípravy na 30 min s vysokou citlivostí pro FLR a MS detekci. Díky porovnatelnosti s historickými 2-AB daty lze přejít k moderním UPLC/Mass spektrometrickým rutinám bez narušení sledovacích trendů v QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace pikové kapacity pro high-throughput screening N-glykosylací.
• Rozšíření přístupu GU kalibrace do klinických diagnostických laboratoří.
• Adaptace protokolů pro komplexní O-glykosylaci a jiné posttranslační modifikace.
• Integrace do platformy pro multi-omics analýzy a dokumentaci pomocí LIMS systémů.

Závěr

Sada GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Kit ve spojení s BEH Amide HILIC kolónami poskytuje rychlou, citlivou a vysoce reprodukovatelnou přípravu a separaci N-glykosylovaných vzorků. Validované standardy a GU kalibrace dále zvyšují spolehlivost a usnadňují implementaci v rutinní analýze.

Reference

1. Ohtsubo K.; Marth J. D., Cell 2006, 126(5), 855–67.
2. Mechref Y. a kol., Bioanalysis 2012, 4(20), 2457–69.
3. Ruhaak L. R. a kol., Mol Cell Proteomics 2013, 12(4), 846–55.
4. Dalziel M. a kol., Science 2014, 343(6166), 1235681.
5. Beck A. a kol., Anal Chem 2013, 85(2), 715–36.
6. Mechref Y. a kol., Mol Cell Proteomics 2013, 12(4), 874–84.
7. Ruhaak L. R. a kol., Anal Bioanal Chem 2010, 397(8), 3457–81.
8. Lauber M. A. a kol., Waters Application Note 720005275EN 2015.
9. Yu Y. Q. a kol., Rapid Commun Mass Spectrom 2005, 19(16), 2331–6.
10. Koza S. M. a kol., Waters Application Note 720005214EN 2015.
11. Campbell M. P. a kol., Bioinformatics 2008, 24(9), 1214–6.