CSH130 C18 Columns for Peptide Separations

Význam tématu

V oblasti proteomiky a peptidové analýzy je klíčové dosáhnout vysoké rozlišovací schopnosti a citlivosti při separaci komplexních směsí peptidů. Volba optimální chromatografické metody a stacionární fáze výrazně ovlivňuje tvar špiček, kapacitu separace a kvalitu hmotnostního signálu při LC-MS analýze. Charged Surface Hybrid (CSH) technologie přináší povrchově funkcionalizované C18 částice s nízkou kladnou nábojem, což zlepšuje retenci a tvar peptidových špiček jak v silně jodobaných eluentech s TFA, tak v mírných kyselinách s formiátovou voda pro maximální citlivost MS detekce.

Cíle studie a přehled

Cílem představené aplikace je ukázat:

• Schopnost CSH130 C18 kolony poskytovat vysokou kapacitu špiček (peak capacity) při separacích peptidů a malých proteinů do 10 kDa.
• Využitelnost standardních elučních směsí s 0,1 % TFA i šetrného 0,1 % FA bez nutnosti kompromisu mezi kvalitou separace a MS signálem.
• Zvýšenou hmotnostní zátěž vzorku a škálovatelnost stacionární fáze od nano- až po laboratorní úrovně.

Použitá metodika a instrumentace

Pro vyhodnocení výkonu byly použity:

• ACQUITY UPLC® CSH130 C18 kolony (1,7 µm, 130 Å) dimenzí 1,0×50–2,1×150 mm.
• XSelect CSH130 C18 XP kolony (2,5 µm, 130 Å) pro HPLC škálování.
• Mobilní fáze obsahující 0,1 % formiové nebo trifluoroctové kyseliny.
• Testovací směs MassPREP™ Peptide Standard pro kapacitní i hmotnostní zatěžovací studie.
• QC test s tryptickým rozštěpem cytochromu c pro posouzení opakovatelnosti mezi šaržemi.

Hlavní výsledky a diskuse

Studie ukázala, že:

• CSH130 C18 poskytuje kapacitu špiček nad 300 při použití TFA i FA, přičemž rozdíl je minimální.
• MS signál je v přítomnosti 0,1 % FA až 4× vyšší než při 0,1 % TFA díky omezenému iontovému párování.
• Při vyšších hmotnostních zátěžích (0,6 µg peptidů) si CSH částice zachovávají ostřejší tvar špiček a vyšší kapacitu než běžné hybridní i plně pórovité C18 fáze.
• Škálování z UPLC na HPLC kolony (poměr 1,7 µm vs. 2,5 µm) proběhlo jednoduchým snížením průtoku a prodloužením gradientu o faktor 1,5 s minimální ztrátou rozlišení.

Přínosy a praktické využití metody

Systém CSH130 C18 nabízí:

• Vysokou kapacitu separace pro proteomické analýzy i peptidové mapování.
• Možnost volby mezi vysokou ostrostí špiček (TFA) a vyšší MS citlivostí (FA).
• Škálovatelnost od nano-LC až po lab-scale purifikaci syntetických peptidů.
• Reprodukovatelnost výkonu díky QC testování každé šarže pomocí cytochromu c digestu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry dalšího vývoje zahrnují:

• Optimalizaci povrchových modifikací pro specifické třídy peptidů a posttranslační modifikace.
• Integraci CSH technologií do mikrofluidních a kapilárních systémech pro vyšší škálovatelnost.
• Vývoj vícefunkčních fází kombinujících reverzní fázi s iontovou výměnou pro komplexní proteomické workflow.
• Využití umělé inteligence pro predikci optimálních podmínek separace na CSH kolónách.

Závěr

Charged Surface Hybrid CSH130 C18 kolony představují univerzální stacionární fázi pro vysoce výkonné peptidové separace v LC a LC-MS aplikacích. Poskytují bezkonkurenční kombinaci vysoké kapacity špiček, možnosti volby elučních podmínek a zvýšené hmotnostní zátěže vzorku. Díky snadné škálovatelnosti a přísnému QA testování každé šarže se jedná o spolehlivé řešení pro výzkum, proteomiku i rutinní QC laboratoře.

Reference

1. Lauber M.A., Koza S.M., Fountain K.J. Increasing Peak Capacity in Reversed Phase Peptide Separations with Charged Surface Hybrid (CSH) C18 Columns. Waters Application Note, 720004568EN, 2013.
2. Lauber M.A., Koza S.M., Fountain K.J. Peptide Mapping and Small Protein Separations with Charged Surface Hybrid (CSH) C18 and TFA-Free Mobile Phases. Waters Application Note, 720004571EN, 2013.
3. Iraneta P.C., Wyndham K.D., McCabe D.R., Walter T.H. Charged Surface Hybrid (CSH) Technology and Its Use in Liquid Chromatography. Waters White Paper, 720003929EN, 2011.
4. Wyndham K.D. et al. Characterization and evaluation of C18 HPLC stationary phases based on ethyl-bridged hybrid organic/inorganic particles. Anal Chem, 2003, 75(24), 6781–6788.