A Validated Method for the Quantification of Clopidogrel in Human Plasma at the 2.5 pg/mL Level Using Xevo TQD, ACQUITY UPLC H-Class System, and UNIFI Scientific Information System

Význam tématu

Clopidogrel je thienopyridinové pro-lék s klíčovou rolí v prevenci trombotických příhod. Jeho farmakologická aktivita je zprostředkována reaktivním thiol-metabolitem, který se v krvi vyskytuje ve velmi nízkých koncentracích. Stanovení koncentrace nezměněného pro-léku v plazmě je proto analytickou výzvou, která vyžaduje metodu s vysokou citlivostí a robustností. Přesné a spolehlivé vyhodnocení hladin clopidogrelu je nezbytné pro farmakokinetické studie, terapeutický monitoring a rozvoj nových léčebných postupů.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout a validovat vysoce citlivou LC/MS/MS metodu pro kvantifikaci clopidogrelu v lidské plazmě s dolní hranicí kvantifikace 2,5 pg/mL. Studie popisuje postup extrakce vzorků, chromatografickou separaci na UPLC C18 koloně a detekci pomocí Xevo TQD hmotnostního spektrometru v režimu MRM.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy byly zpracovány na Oasis MCX µElution SPE destičce za použití deuterovaného interního standardu. Separace probíhala na ACQUITY UPLC H-Class systému s C18 kolónou (2,1×50 mm, 1,7 µm) v 3minutovém gradientu při průtoku 600 µL/min. Detekce probíhala na Xevo TQD MS v pozitivním ESI režimu monitorováním přechodů 322→212 pro clopidogrel a 326→216 pro interní standard.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila dosažení LLOQ 2,5 pg/mL s korelačními koeficienty 0,9988–0,9995 (1/x vážená regrese). Intra- a interdenní přesnost (%CV) pro LLOQ činila 5,8–12,2 % a bias se pohyboval mezi -13,6 až -6,9 %. Pro vysokou QC úroveň (300 pg/mL) byla %CV <3 % a bias kolem 1,5 %. Chromatografické píky byly ostré a symetrické, bez významného carryover, což umožňuje zpracování minimálně 2×96 vzorků denně.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost kvantifikace clopidogrelu v ultranízkých koncentracích pro farmakokinetické a bioekvivalenční studie
• Rychlá analýza 3 minuty na vzorek s vysokou propustností laboratoře
• Minimální carryover a validez splňující mezinárodní kritéria FDA a EMA

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze rozšířit o multiplexní stanovení aktivního thiol-metabolitu a dalších derivátů thienopyridinů. Integrace s automatizovanými platformami pro přípravu vzorků může dále zvýšit kapacitu a efektivitu laboratoří. Podobné přístupy lze aplikovat na vývoj ultra citlivých metod pro jiné farmakologicky významné sloučeniny.

Závěr

Vyvinutá a validovaná UPLC-MS/MS metoda poskytuje vysokou citlivost, přesnost a opakovatelnost pro stanovení clopidogrelu na úrovni pg/mL v lidské plazmě. Splňuje požadavky na LLOQ, přesnost a robustnost, což ji předurčuje k rutinnímu nasazení v bioanalytických laboratořích.

Reference

1. Pereillo JM, Maftouh M, Andrieu A, Uzabiaga MF, Fedeli O, Savi P, Pascal M, Herbert JM, Maffrand JP, Picard C. Structure and stereochemistry of the active metabolite of clopidogrel. Drug Metab Dispos. 2002;30(11):1288–1295.