A Validated Liquid-Liquid Extraction Method with Direct Injection of Hexane for Clopidogrel in Human Plasma Using UltraPerformance Convergence Chromatography (UPC2) and Xevo TQ-S

Význam tématu

Clopidogrel je prodrug používaný k prevenci trombotických událostí a jeho monitoring v lidské plazmě je klíčový pro hodnocení farmakokinetiky a bezpečnosti léčby. Vysoce citlivá a spolehlivá bioanalytická metoda umožňuje přesné stanovení nízkých koncentrací aktivního metabolitu a neaktivních forem v klinických i průmyslových laboratořích.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a validovat metodu spojení extrakce tekutá tekutá bez nutnosti sušení a přímou injekci hexanového extraktu na UPC2 MS analytiku pro stanovení clopidogrelu v rozsahu 25 až 5000 pg/mL lidské plazmy. Studie demonstruje robustnost, linearitu a nízké carryover metody.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: 200 µL plazmy smíchaných s 20 µL interního standardu, extrakce 600 µL hexanu, vortex, centrifugace a přenos supernatantu do LC lahvičky
• Chromatografie: ACQUITY UPC2 BEH kolona 3x100 mm, 1,7 µm při 40 °C, gradient CO2 a 0,1 % kyseliny mravenčí v acetonitrilu od poměru 98 2 do 70 30 během 2 minut, průtok 1,4 mL/min
• Detekce: Xevo TQ-S, MRM pozitivní ionizace, přechody 322 212 pro clopidogrel a 326 216 pro deuterovaný interní standard

Hlavní výsledky a diskuse

Clopidogrel eluoval za 1,6 minuty s pevným a symetrickým tvarem píku širokým přibližně tři sekundy. Při nejnižší kalibrační úrovni 25 pg/mL byl signál vůči šumu kolem 60 1. Po injekci standardu 5000 pg/mL následoval blank bez pozorovatelného carryover. Linearita metody se pohybovala mezi korelačními koeficienty 0,996 a 0,999. Intra denní i mezi denní přesnost a správnost splňovaly požadavky s CV do 11,1 % a bias v rámci ±15 % pro LLOQ i QC úrovně.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda kombinuje čistotu extraktu typickou pro LLE s vysokou propustností přímé injekce bez sušení a rekonstituce. Snížení doby přípravy vzorku a eliminace možných ztrát analyzovaného materiálu vede ke zrychlení procesů v bioanalytické laboratoři. Nízké náklady na organický rozpouštěč a efektivní separace UPC2 otevírají prostor pro rutinní stanovení v preklinickém i klinickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření přístupu convergence chromatografie na další skupiny léků s nízkými dávkami a termolabilními sloučeninami. Automatizace LLE extrakce a integrace do vysokopropustných platforem může dále zvýšit efektivitu. Kombinace s HRMS technologií rozšíří možnosti simultánního stanovení více metabolitů a lékových interakcí.

Závěr

Popsaná UPC2 MS metoda umožňuje rychlé, citlivé a reprodukovatelné stanovení clopidogrelu v lidské plazmě bez náročných kroků sušení a rekonstituce vzorku. Validace prokázala vynikající parametry linearity, přesnosti, správnosti i minimální carryover, což zajišťuje spolehlivost analýzy pro farmakokinetické studie i QA QC aplikace.

Reference

1. Pereillo JM Maftouh M Andrieu A Uzabiaga MF Fedeli O Savi P Pascal M Herbert JM Maffrand JP Picard C Structure and stereochemie of the active metabolite of clopidogrel Drug Metabolism and Disposition 2002 30 1288 1295
2. Bongfiglio R King R Olah T Merkle K The effects of sample preparation methods on the variability of the electrospray ionization response for model drug compounds Rapid Communications in Mass Spectrometry 1999 13 1175 1185